黃大野，高 葦，賁海燕，方 偉，王開梅，曹春霞※，饒 犇，劉曉艷，萬中義，張亞妮，姚經(jīng)武，朱志剛

（1. 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢430064；2. 天津市農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，天津 300381；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

0 引 言

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是番茄的主要?dú)缧圆『Γ芮秩竟麑?shí)、花、葉、莖和種子[1-2]。防治該病害主要依靠單一作用位點(diǎn)的化學(xué)殺菌劑，如多菌靈、異菌脲、嘧菌環(huán)胺和啶酰菌胺等。但是，化學(xué)殺菌劑的使用極易造成灰霉病產(chǎn)生抗藥性，在中國和世界范圍內(nèi)，灰葡萄孢已經(jīng)對多種殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[3-8]。另外也會造成農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染并威脅人類健康[9-10]。所以生產(chǎn)上急需更為安全有效的殺菌劑和防治方法。

與化學(xué)殺菌劑相比，生物制劑具有很多優(yōu)勢，利用多種作用機(jī)理來抑制病害的發(fā)生，如競爭位點(diǎn)和營養(yǎng)、重寄生作用、誘導(dǎo)抗性和產(chǎn)生次生抑菌物質(zhì)等[11-13]。鏈霉菌是一種被廣泛利用的生防菌，可以產(chǎn)生多種類型的天然產(chǎn)物，作為防治作物病害活性化合物。許多鏈霉菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物如多氧霉素、春雷霉素和井崗霉素等已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[14-16]鏈霉菌產(chǎn)生的。

諾沃霉素A和B是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和鑒定的2種全新結(jié)構(gòu)的32元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物分子量 1 228.66。其產(chǎn)生菌為植生鏈霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌種代號為 HBERC-20821， 保存在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO：M2013379。鏈霉菌分離自四川瓦屋山采集的土樣。前期研究了液體發(fā)酵制備諾沃霉素的方法和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的簡單濃縮工藝[17-19]。大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入試驗表明未造成明顯病理改變，毒性為微毒級[20]。通過瓊脂稀釋法測定了諾沃霉素A和B對幾種植物病原菌minimum inhibition concentration（最小抑制濃度），結(jié)果表明對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和穎枯殼針孢（Septoria nodorum）等幾種植物病原真菌具有良好抑制效果。諾沃霉素A和B只在側(cè)鏈有一處細(xì)微區(qū)別，母核結(jié)構(gòu)相同。前期初步測定殺菌活性，發(fā)現(xiàn)殺菌活性無明顯差異，故只對A殺菌性能進(jìn)行進(jìn)一步研究[19]。本試驗選取諾沃霉素A進(jìn)行對番茄果實(shí)灰霉病的防治效果研究，以期為諾沃霉素今后在防治番茄采后灰霉病的應(yīng)用和推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：灰葡萄孢（B. cinerea）為多菌靈敏感菌株，核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、多主棒孢（Corynespora cassiicola）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茶褐斑擬盤多毛孢（Pestalotiopsis guepinii）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存。

供試藥物：諾沃霉素 A原藥（有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%），制備方法參考文獻(xiàn)[17]。98%多菌靈原藥（安徽廣信農(nóng)化股份有限公司）。番茄為市場購買大番茄，品種為紅星二號。

1.2 諾沃霉素A對灰葡萄孢離體抑菌效果

將灰葡萄孢菌從保存斜面活化到potato dextrose ager（PDA）培養(yǎng)基20℃培養(yǎng)5 d備用。將諾沃霉素A原藥加入母液體積 1%N，N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）溶解，隨即加入無菌水配制成濃度為100μg/mL母液備用。多菌靈母液的配制方法和濃度同諾沃霉素 A。采用菌絲生長速率法，使用梯度稀釋將諾沃霉素 A 稀釋至25、12.5、6.25、3.125 和1.562 5μg/mL。多菌靈稀釋至10.0、5.0、2.5、1.0和0.5μg/mL。待培養(yǎng)基溫度降為45 ℃時，用滅菌槍頭吸取1 mL藥液，隨后加入9 mLPDA培養(yǎng)基混勻，即藥液稀釋10倍，每個梯度濃度3次重復(fù)，以加入含1%DMF無菌水作為對照。隨后用4 mm直徑打孔器打取PDA平板培養(yǎng)的灰葡萄孢，接入各處理PDA平板中央。20℃黑暗培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑，用DPS軟件求出諾沃霉素A和多菌靈對灰葡萄孢菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度EC50（50% effective concentration）。

分別挑取少許含1.25μg/mL諾沃霉素A平板和對照菌絲于載玻片，在40倍光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX21,Tokyo，Japan）觀察處理和對照菌絲形態(tài)。

1.3 諾沃霉素A防治番茄果實(shí)灰霉病研究

將灰葡萄孢菌在PDA平板25℃培養(yǎng)14 d，用無菌水刷取孢子懸浮液，將其混入 0.05%的吐溫 80，隨后用紗布過濾，使用血球計數(shù)板將孢子濃度調(diào)到 5×104個孢子/mL。從市場購買大小一致，外皮沒有破損的番茄。

用帶1 mL無菌槍頭分子槍在番茄中部相對應(yīng)的兩側(cè)打孔，將諾沃霉素 A 稀釋至 50 和 100μg/mL，浸果10 min，對照藥劑使用有效成分25和12.5μg/mL多菌靈浸果10 min，空白對照使用無菌水浸果10 min。取出風(fēng)干后滴入10μL灰霉孢子懸浮液，25℃保濕培養(yǎng)6 d[21-26]，試驗設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10個番茄果實(shí)。統(tǒng)計方法和防效計算同上。

1.4 諾沃霉素A抑菌譜測定

按照1.2制備100μg/mL諾沃霉素A，采用菌絲生長速率法觀察10μg/mL含藥PDA培養(yǎng)基條件下對7種常見植物病原菌抑制效果，以加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%DMF無菌水作為對照。防效計算方法同上。勞爾氏菌在nutrient ager（NA）平板活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)入 SPA培養(yǎng)基，于170 r/min轉(zhuǎn)速、30℃培養(yǎng) 24 h 后，將菌液均稀釋至108cfu/mL，將0.5 mL菌液與45℃ 9.5 mL NA固體培養(yǎng)基混合制成含菌平板。隨后放入滅菌濾紙片，滴入10μL諾沃霉素A藥液，對照藥劑為平板濃度10μg/mL氨芐青霉素鈉，3 d后觀察抑菌圈。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用DPS進(jìn)行毒力回歸方程計算，SAS9.1.3進(jìn)行差異顯著性分析，在0.05水平下進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾沃霉素A對灰葡萄孢離體抑菌效果

表1為諾沃霉素A與多靈菌抑菌活性對比，諾沃霉素A對灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，離體條件下在2.5、1.25、0.625、0.312 5和0.156 25μg/mL 5個梯度濃度均有一定的抑菌效果，經(jīng)計算EC50為0.631μg/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，說明試驗濃度梯度設(shè)置合理。生產(chǎn)上防治灰霉病常用殺菌劑多菌靈EC50為0.157μg/mL，諾沃霉素A殺菌活性略低于多菌靈。與對照菌絲相比，經(jīng)1.25μg/mL諾沃霉素A處理5 d后灰葡萄孢菌絲發(fā)生明顯的膨脹、扭曲和變形（圖 1），菌絲微觀形態(tài)的影響可能是抑制灰霉病生長的一個重要因素。

表1 諾沃霉素A對灰葡萄孢抑菌活性Table 1 Inhibition activity of novonestmycin A on Botrytis cinerea

圖1 顯微鏡條件下諾沃霉素A對菌絲生長影響Fig.1 Optical micrographs of the inhibition of fungal growth by novonestmycin A

2.2 諾沃霉素A預(yù)防番茄果實(shí)灰霉病效果

表 2為諾沃霉素 A、多靈菌及對照組對番茄灰霉病預(yù)防效果對比，離體組織試驗表明，諾沃霉素 A對番茄果實(shí)灰霉病具有良好的防治效果。諾沃霉素 A在 50和100μg/mL浸果處理對番茄果實(shí)灰霉病防效分別達(dá)到68.29%和100%。多菌靈在12.5和25μg/mL浸果處理對番茄果實(shí)灰霉病防效分別為69.51%和100%。在處理濃度下諾沃霉素A和多菌靈對番茄果實(shí)灰霉病預(yù)防效果相當(dāng)（P<0.05）。試驗過程中在50和100μg/mL浸果處理條件下均未發(fā)現(xiàn)諾沃霉素對番茄果實(shí)表觀造成藥害，試驗濃度下對番茄果表觀形態(tài)安全（見圖2）。100μg/mL及更高濃度可以作為實(shí)際應(yīng)用中諾沃霉素A的浸果濃度，更高濃度諾沃霉素A對番茄果實(shí)安全性及最佳浸果時間需要進(jìn)一步研究。

表2 諾沃霉素A對番茄灰霉病預(yù)防效果Table 2 Prevention of novonestmycin A on tomato gray mold

圖2 諾沃霉素A對番茄果實(shí)灰霉預(yù)防效果Fig.2 Prevention effect of novonestmycin A on tomato fruit gray mold

2.3 諾沃霉素A抑菌譜

抑菌譜試驗結(jié)果見表3，試驗表明，諾沃霉素 A在10μg/mL條件下對子囊菌核盤菌S.sclerotiorum抑菌率為86.11%、對半知菌多主棒孢C.cassiicola、茄鏈格孢A.solani、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、茶褐斑擬盤多毛孢P.guepinii和擔(dān)子菌立枯絲核菌R.solani抑菌效果分別為91.11%、82.78%、77.22%、86.46%和85.56%，抑菌率均達(dá)到75%以上。對卵菌綱辣椒疫霉P.capsici無抑菌作用。在細(xì)菌抑菌試驗中，抑菌圈法表明諾沃霉素A在10μg/mL處理條件下對勞爾氏菌R.solanacearum無抑菌圈，而對照殺細(xì)菌藥劑氨芐青霉素鈉在相同濃度下具有明顯抑菌圈（圖 3），即諾沃霉素 A對細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無抑菌效果。諾沃霉素A在防治半知菌引起的作物病害表現(xiàn)出一定的防治潛力，對由上述病原菌引起的病害的田間防效、應(yīng)用技術(shù)及對應(yīng)作物的安全性需要進(jìn)一步評價。

表3 諾沃霉素A對植物病原菌離體抑菌效果Table 3 In vitro inhibition of plant pathogens with novonestmycin A

圖3 諾沃霉素對勞爾氏菌抑菌活性Fig.3 Inhibition activity of novonestmycin A on Ralstonia solanacearum

3 討 論

研究表明諾沃霉素A對番茄果實(shí)灰霉病具有良好的預(yù)防效果，對其作用機(jī)理和與其他灰霉病防治藥劑的交互抗藥性值得進(jìn)一步研究，為灰霉病抗性菌株的治理和殺菌劑交替和混合使用奠定基礎(chǔ)。

諾沃霉素A對常見植物病原真菌核盤菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等具有良好抑制效果，其離體抑菌活性均為首次報道。其對卵菌綱疫霉菌無效，不能用于其引起的作物疫病的防治。對細(xì)菌勞爾氏菌無效，不能用于其引起的作物細(xì)菌青枯病防治。本研究共研究 9種病原菌抑菌活性，還需對其抑菌譜進(jìn)行更深入的研究。在試驗濃度下，對番茄表皮未造成影響，高濃度下對番茄的安全性需要進(jìn)一步研究。

最近的研究表明大環(huán)內(nèi)酯類化合物抑菌機(jī)理為直接與真菌細(xì)胞膜麥角甾醇結(jié)合從而抑制真菌生長[27-29]。麥角甾醇是子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌等大多數(shù)真菌細(xì)胞膜重要組成部分，卵菌綱病害和細(xì)菌不含有麥角甾醇[30]。諾沃霉素A對卵菌綱辣椒疫霉菌P. capsici和細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無效，而對其他隸屬于囊菌、半知菌和擔(dān)子菌 6種真菌具有明顯的抑菌效果。通過其化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和抑菌譜研究表明麥角甾醇可能為諾沃霉素A抑制真菌的作用靶標(biāo)，藥劑對真菌麥角甾醇合成影響需要進(jìn)一步驗證。

大環(huán)內(nèi)脂類抗生素納他霉素通過作用于麥角甾醇而對大多數(shù)真菌和酵母菌具有抑制和殺滅活性，其具有不易產(chǎn)生抗藥性，無致癌、致畸形、致突變和過敏性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品防腐和水果保鮮[31]。同為大環(huán)內(nèi)酯諾沃霉素在食品防腐和其他水果保鮮，例如柑橘青霉病的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過離體抑菌、果實(shí)預(yù)防和抑菌譜試驗，研究結(jié)果如下：

1）諾沃霉素A對灰葡萄孢具有良好的抑菌效果，離體抑制中濃度為0.631μg/mL。

2）經(jīng)1.25μg/mL 諾沃霉素A處理的菌絲發(fā)生明顯的腫脹和變形。經(jīng)50和100μg/mL諾沃霉素A浸果處理對番茄果實(shí)灰霉病防效分別為68.29%和100%。對番茄安全無藥害，在防治番茄果實(shí)灰霉病具有良好的應(yīng)用前景。

3）諾沃霉素A對核盤菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等常見植物病原真菌具有抑菌效果，對卵菌綱辣椒疫霉P.capsici和細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無效。

[1]Dik A J, Elad Y. Comparison of antagonists ofBotrytis cinereain greenhousegrown cucumber and tomato under different climatic conditions [J]. European Journal of Plant Pathology, 1999, 105: 123－127.

[2]Eden M A, Hill R A, Beresford R, et al. The influence of inoculum concentration, relative humidity and temperature on infection of greenhouse tomatoes byBotrytis cinerea[J].Plant Pathology, 1996, 45: 795－806.

[3]Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, et al.Botrytis cinerea: The cause of grey mould disease [J]. Molecular Plant Pathology,2007 (8): 561－580.

[4]Ding Z, Liu F, Wang H L, et al. Studies on multiple fungicide resistance toBotrytis cinerea[J]. Journal of Shandong Agricultural University, 2001, 32(4): 452－456.

[5]Li X, Fernández-Ortu?o D, Grabke A,et al. Resistance to fludioxonil inBotrytis cinereaisolates from blackberry and strawberry [J]. Phytopathology, 2014, 104(7): 724－732.

[6]Lu X H, Jiao X L, Hao J J, et al. Characterization of resistance to multiple fungicides inBotrytis cinerea,populations from Asian ginseng in northeastern China [J].European Journal of Plant Pathology, 2016, 144(3): 467－476.

[7]Fan F, Li N, Li G,et al. Occurrence of fungicide resistance inBotrytis cinereafrom greenhouse tomatos in Hubei Province,China [J]. Plant Disease, 2016, 100(12): 2414－2421.

[8]Fan F, Hamada M, Li N, et al. Multiple fungicide resistance inBotrytis cinereafrom greenhouse strawberries in Hubei Province, China [J]. Plant Disease, 2017, 101(4): 1－6.

[9]Vakalounakis D J, Doulis A G, Klironomou E.Characterization ofFusarium oxysporumf. sp.radiciscucumeriumattacking melon under natural condition in Greece [J]. Plant Pathology, 2005, 54(3): 339－346.

[10]Gupta S, Gupta R, Sharma S. Impact of chemical and bio-pesticides on bacterial diversity in rhizosphere ofVigna radiata[J]. Ecotoxicology, 2013, 22(10): 1479－1489.

[11]陳志誼. 芽孢桿菌類生物殺菌劑的研發(fā)與應(yīng)用[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31(5)：723－732.Chen Zhiyi. Research and application of bio-fungicide with bacillus spp. [J]. Chinese Journal of Biological Control, 2015,31(5): 723－732. (in Chinese with English abstract)

[12]陳捷. 木霉菌誘導(dǎo)植物抗病性研究新進(jìn)展[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31(5)：733－741.Chen Jie. Advances on trichoderma-induced plant resistance against diseases[J]. Chinese Journal of Biological Control,2015, 31(5): 733－741. (in Chinese with English abstract)

[13]Chen Y Y, Chen P C, Tsay T T. The biocontrol efficacy and antibiotic activity of Streptomyces plicatus, on the oomycete Phytophthora capsici[J]. Biological Control, 2016, 98: 34－42.

[14]Liu C X, Zhang J, Wang X J, et al. Antifungal activity of borrelidin produced by a Streptomyces strain isolated from soybean[J]. J Agric Food Chem, 2012, 60(5): 1251－1257.

[15]Xiong Z Q, Tu X R, Wei S J, et al. The mechanism of antifungal action of a new polyene macrolide antibiotic antifungalmycin 702 from Streptomyces padanus JAU4234 on the rice sheath blight pathogenRhizoctonia solani[J]. Plos One, 2013, 8(8): e73884.

[16]Xiong Z Q, Zhang Z P, Li J H, et al. Characterization of streptomyces padanus JAU4234, a producer of actinomycin X2, fungichromin, and a new polyene macrolide antibiotic[J].Applied & Environmental Microbiology, 2012, 78(2): 589－592.

[17]湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心. 植生鏈霉菌及其產(chǎn)生抗生素諾沃巢霉素的方法與應(yīng)用, 103740606 B[P]. 2017-01-04.

[18]丁璟劍，萬中義，方偉等. 諾沃霉素植生鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54(16)：3928－3931.Ding Jingjian, Wan Zhongyi, Fang Wei, et al. Optimization of Fermentation Media with Novonestmycin[J]. Hubei Agricultural Science, 2015, 54(16): 3928－3931. (in Chinese with English abstract)

[19]Wan Z, Fang W, Shi L, et al. Novonestmycins A and B, two new 32-membered bioactive macrolides from Streptomyces phytohabitans HBERC-20821[J]. Journal of Antibiotics,2015, 68(3): 185－190.

[20]萬中義. 新型農(nóng)用抗生素的篩選、鑒定及開發(fā)前景評價[D].武漢: 武漢大學(xué)，2014，118－120.Wan Zhongyi. Biopesticide Activities Screening, Structure Identification and Evaluation on Development Prospects of New Agricultural Antibiotics[D]. Wuhan: Wuhan University,2014, 118－120. (in Chinese with English abstract)

[21]龍清紅，高梵，李曉安，等. BABA處理對葡萄果實(shí)采后灰霉病的影響及機(jī)理[J]. 食品科學(xué)，2016，37(14)：213－218.Long Qinghong, Gao Fan, Li Xiaoan, et al. Effect and mechanism ofβ-aminobutyric acid on Incidence of grey mould decay in postharvest grape.[J]. Chinese Journal of Food Science, 2016, 37(14): 213－218. (in Chinese with English abstract)

[22]申順善，張瑩瑩，張維娜，等. 綠針假單胞菌HL5-4對番茄灰霉菌的抑制活性及其定殖能力[J]. 園藝學(xué)報，2016，43(6)：1195－1202.Shen Shunshan, Zhang Yingying, Zhang Weina, et al.Antifungal activity ofPseudomonas choloeaphtisHL5-4 against tomato gray mold and its colonization ability[J].Chinese Journal of Acta Horticulturae Sinica, 2016, 43(6):1195－1202. (in Chinese with English abstract)

[23]鞏文峰，李月飛，上官妮妮，等. 出芽短梗霉對蘋果采后灰霉病的防治[J]. 中國生物防治學(xué)報，2016，32(2)：251－257.Gong Wenfeng, Li Yuefei, Shang Guannini, et al. Control of apple postharvest gray mold byAureobasidium pullulans[J].Chinese Journal of Biological Control, 2016, 32(2): 251－257.(in Chinese with English abstract)

[24]Mu?oz Z, Moret A. Sensitivity ofBotrytis cinereato chitosan and acibenzolar-S-methyl[J]. Pest Management Science,2010, 66(9): 974－979

[25]Zong Y, Jia L, Li B, et al. Effects of yeast antagonists in combination with hot water treatment on postharvest diseases of tomato fruit[J]. Biological Control, 2010, 54(3):316－321.

[26]Zhang C F, Chen K S, Wang G L. Combination of the biocontrol yeastCryptococcus laurentiiwith UV-c treatment for control of postharvest diseases of tomato fruit [J].Biocontrol, 2013, 58(2): 269－281.

[27]曾繁旭，喬建軍. 多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究進(jìn)展[J].中國抗生素雜志，2014，39(3)：171－181.Zeng Fanxu, Qiao Jianjun. Advance in the study on polyene macrolide antibiotic[J]. Chinese Journal of antibiotics, 2014,39(3): 171－181. (in Chinese with English abstract)

[28]te Welscher Y M, van Leeuwen M R, de Kruijff B, et al.Polyene antibiotic that inhibits membrane transport proteins[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(28): 11156－11159.

[29]Gray K C, Palacios D S, Dailey I, et al. Amphotericin primarily kills yeast by simply binding ergosterol[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(7): 2234－2239.

[30]鄧玉清，王紀(jì)，虞龍. 微生物麥角甾醇的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志，2001，21(3)：45－47.Deng Yuqing, Wang Ji, Yu Long. Advances in microbial ergoster[J]. Chinese Journal of microbiology, 2001, 21(3):45－47. (in Chinese with English abstract)

[31]閆徳博，盧彩鴿，王俊麗，等. 利迪鏈霉菌 G117產(chǎn)納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2015，30(增刊1)：296－302.Yan Debo, Lu Caige, Wang Junli, et al. Optimization of fermentation medium components for natamycin producing by Streptomyces lydicus G177. [J]. Chinese Journal of Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2015, 30(supp. 1): 296－302. (in Chinese with English abstract)