喻 晶，李運(yùn)雷，劉曉翌 (北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518036)

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%，大部分NSCLC患者就診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)［1］。NSCLC中存在多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因，其中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因是NSCLC分子靶向治療最重要的靶點(diǎn)，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)已成為治療NSCLC的重要手段，而EGFR基因突變是EGRF-TKI療效的預(yù)測指標(biāo)［2，3］。有 EGFR 基因突變的 NSCLC患者在EGFR-TKI靶向治療中不僅生存獲益，且患者生活質(zhì)量提高，不良反應(yīng)小。目前腫瘤組織是EGFR突變檢測的首選樣本［2］，但對(duì)于晚期無法獲得組織樣本的NSCLC患者，只能采用其他類型的樣本進(jìn)行EGFR突變檢測，本研究探討不同類型樣本在EGFR基因突變檢測中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床合理選擇樣本類型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2013年12月～2018年4月北京大學(xué)深圳醫(yī)院238例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)門診及住院患者的樣本，其中組織樣本105例，血漿樣本115例，胸腔積液樣本18例。男性135例，平均年齡為57.5歲;女性103例，平均年齡56.8歲。肺腺癌197例，其他非小細(xì)胞肺癌41例。根據(jù)病程分期，I和II期的NSCLC患者20例，III和IV期的患者127例。12例NSCLC患者同時(shí)提供組織和血漿樣本，4例患者同時(shí)提供了胸腔積液和血漿標(biāo)本。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑:人類EGFR基因突變檢測試劑盒，石蠟組織(FFPE)核酸提取試劑，血漿游離DNA核酸提取試劑盒和胸腔積液核酸提取試劑盒均由廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2.2 儀器:ABI7500熒光定量擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)(美國Nanodrop公司)。

1.3 方法

1.3.1 石蠟樣本DNA提取:由病理醫(yī)師確定腫瘤區(qū)域后，用一次性手術(shù)刀片刮取5～10 μm石蠟切片5～10張到EP管中，按照FFPE核酸提取試劑盒的說明書提取DNA。

1.3.2 血漿游離DNA提取:用EDTA抗凝管采血5～6 ml，采用2次離心法分離血漿(2000 r/min離心10 min，取上清，然后8000 r/min離心10 min)，分離的血漿樣本不少于2 ml，按照血漿游離DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.3 胸腔積液樣本DNA提取:取胸腔積液樣本40 ml，2000 r/min 離心 10 min，棄上清，加入生理鹽水吹打混勻，置于EP管中，13000 r/min離心5 min，棄上清，按照胸腔積液核酸提取試劑盒提取DNA。

1.3.4 EGFR基因熒光擴(kuò)增:提取的DNA通過Nanodrop微量分光光度計(jì)測定DNA濃度和質(zhì)量，將DNA濃度稀釋到1～3 ng/L，按照人類EGFR基因突變檢測試劑盒說明書的程序擴(kuò)增并分析結(jié)果。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS分析軟件，EGFR突變?cè)诓煌瑯颖绢愋?、不同性別、不同年齡、不同病理分型、不同臨床分期的差異比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變類型的分析 238例樣本中，EGFR基因突變106例，突變率為44.5%，其中19號(hào)外顯子的缺失突變(19del)62例(58.5%，62/106)，21號(hào)外顯子的替代突變(L858R)36例(34.0%，36/106)，18號(hào)外顯子的替代突變(G719X)4例(3.8%，4/106)，20號(hào)外顯子的插入突變(20ins)3例(0.9%，3/106)。

2.2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 見表1。

表1 EGFR突變與臨床特征的關(guān)系

女性NSCLC患者的EGFR突變率(55.3%)，明顯高于男性患者(36.3%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.58，P＜0.01)。年齡＞65歲的 NSCLC 患者EGFR突變率(44.4%)，與≤65歲患者(44.6%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0，P＞0.05)。肺腺癌的EGFR突變檢出率(47.7%)明顯高于其他類型的NSCLC(29.3%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.68，P＜0.05)。臨床I～I(xiàn)I期患者的EGFR突變檢出率(35.0%)，與III～I(xiàn)V期(45.7%)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.79，P＞0.05)。

2.3 不同類型樣本EGFR突變的分析 238例樣本中，石蠟組織、血漿和胸腔積液樣本分別為105例，115例和18例，其突變率分別為52.4%，34.8%和61.1%，與組織樣本相比，血漿樣本的EGFR突變檢出率明顯低于組織樣本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.93，P＜0.05)，但組織與胸腔積液樣本相比其檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.471，P＞0.05)。見表1。12例組織和血漿配對(duì)樣本中，二者結(jié)果一致的樣本為9例，一致率為75%(9/12)，敏感度為50%(2/4)，特異度為87.5%(7/8)。4例胸腔積液與血漿配對(duì)的樣本中，二者的一致率為50%(2/4)。

3 討論EGFR基因是肺癌生長的重要調(diào)控基因［4］，也是肺癌分子靶向治療最重要的靶點(diǎn)，目前EGFR酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)是治療NSCLC的主要方法，而EGFR基因的突變狀態(tài)是EGFRTKI療效的重要預(yù)測因子［2，3］，檢測 EGFR 基因突變可以篩查對(duì)靶向藥物敏感的NSCLC患者，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病人的個(gè)體化靶向治療，使患者受益。

腫瘤組織是EGFR檢測的首選樣本，但對(duì)于無法獲得腫瘤組織的晚期NSCLC患者，只能采用其他類型的樣本進(jìn)行EGFR突變檢測。本研究比較了組織、胸腔積液和血漿三種不同類型的樣本中EGFR突變的檢測情況，結(jié)果顯示，組織和胸腔積液的EGFR突變檢出率沒有明顯差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5］，但是血漿的突變檢出率明顯低于組織，提示在組織樣本無法獲取的情況下，可優(yōu)先選擇胸腔積液樣本。12例血漿與組織配對(duì)的樣本，血漿檢測的敏感度、特異度和一致性分別為50%，87.5%和75%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［6］，提示ARMs法檢測血漿游離DNA(cf DNA)中的EGFR突變，靈敏度不夠高，如果檢測結(jié)果為野生型，需要注意假陰性的可能，其原因可能與腫瘤細(xì)胞釋放進(jìn)入血液的DNA量少有關(guān)。盡管血漿檢測的靈敏度低于組織，對(duì)于無法獲得組織和胸腔積液樣本的病人，可以考慮采用檢測血漿游離DNA中的EGFR突變，動(dòng)態(tài)監(jiān)測療效，本研究中有5例病人使用靶向藥物前后均檢測了血漿cfDNA中的EGFR突變，1例患者用藥后出現(xiàn)了T790M耐藥突變(由19del變?yōu)?9del+T790M雙突變)，2例由19del突變轉(zhuǎn)為野生，還有2例突變狀態(tài)保持不變。用藥后，動(dòng)態(tài)監(jiān)測突變狀態(tài)，有利于臨床觀察療效和耐藥情況，及時(shí)調(diào)整用藥方案。

研究顯示［4］，EGFR基因突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的18～21外顯子上，19外顯子缺失突變(19del)和21外顯子的替代突變(L858R)是對(duì)EGFR-TKI治療敏感的主要突變，20外顯子的插入突變和T790M突變是對(duì)一代TKI治療耐藥的突變，我們的研究顯示19del突變率為58.5%(62/106)，21號(hào)外顯子的L858R突變率為34.0%(36/106)，EGFR的敏感突變集中在19和21號(hào)外顯子，與報(bào)道一致［7］。

綜上所述，臨床可以根據(jù)腫瘤患者的實(shí)際情況選擇合適的樣本進(jìn)行EGFR突變檢測，首選樣本是腫瘤組織，其次是胸腔積液，當(dāng)組織和胸腔積液都無法獲取時(shí)，可以采用血漿樣本，但要注意血漿檢測結(jié)果假陰性的可能。由于本研究組織和血漿，組織和胸腔積液的配對(duì)樣本例數(shù)較少，存在偏倚，需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證。