劉玉林，黃曉楠，趙琪林，胥國(guó)強(qiáng)，趙明才，陳俊霞

(1.遂寧市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川遂寧 629000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，重慶 400016)

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤最常見(jiàn)的類(lèi)型之一，發(fā)病率逐年增高。目前的治療方法包括手術(shù)、化學(xué)療法、免疫療法等，但效果不佳，膀胱癌目前仍具有很高的復(fù)發(fā)率和死亡率［1］，因此尋找新的治療膀胱癌的靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)是一種多功能酸性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，含有460個(gè)氨基酸殘基，包括32個(gè)半胱氨酸殘基和15個(gè)亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)，不僅是核糖核酸酶A(RNase A)的抑制劑，還可能與血管生成素結(jié)合，調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性，抑制腫瘤血管生成［2］。血管生成素(angiogenin，ANG)是非常重要的血管生成因子，由147個(gè)氨基酸組成，其中編碼的蛋白質(zhì)由123個(gè)氨基酸組成，還含有一段信號(hào)肽序列，屬于 RNA酶超家族的一員，具有弱 RNA酶活性［3］。研究表明，ANG在多種腫瘤中表達(dá)升高，與血管生成及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。ANG不僅能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、侵襲而促進(jìn)血管生成，還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制ANG功能可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)及惡化［5］。前期研究證明了RI與ANG 在體內(nèi)存在相互作用［6，7］。然而，RI與 ANG相互作用對(duì)膀胱癌移植瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響未見(jiàn)報(bào)道。為了進(jìn)一步探討RI與ANG的相互作用機(jī)制，我們通過(guò)建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，運(yùn)用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光和免疫印跡法檢測(cè)了通路中的靶蛋白，為膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人膀胱癌BIU87細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物有限公司;BALB/C裸鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，4～6周齡，體重20±3 g。脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;ANG單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;多克隆RI抗體本室保存;其余通路蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司;免疫組化相關(guān)試劑向中杉金橋購(gòu)買(mǎi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各組穩(wěn)定細(xì)胞株的建立:人膀胱癌BIU87細(xì)胞用含10 g/dl胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5 ml/dl CO2。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%左右時(shí)，用 Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-RI(本課題組構(gòu)建保存)，pIRES2-EGFP-ANG，pIRES2-EGFP-RI+pIRES2-EGFP-ANG和pIRES2-EGFP。根據(jù)GenBank提供的人RI cDNA序列(NM_002939)設(shè)計(jì)上游引物:5’-CGGAATTCCTTCACCTCCACCATGAGC-3’;下游引物:5’-GCGTCGACAGGAAGACCTCAGGAGATG-3’;酶切位點(diǎn)為EcoR I和Sal I。ANG cDNA序列(NM_001097577)設(shè)計(jì)上游引物:5’-CCCAAGCTTATGGTGATGGGCCTGGGCG-3’;下游引物:5’-CGGGATCCGCTGGTTACGGACGACGG-3’;酶切位點(diǎn)為HindⅢ和 BamHI。轉(zhuǎn)染 48 h后加入 600 μg/ml G418培養(yǎng)14天，14天后濃度降為 300 μg/ml，最后挑選陽(yáng)性克隆即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別命名為BIU-87+RI，BIU-87+ANG，BIU-87+ANG+RI和 BIU-87+空質(zhì)粒組。

1.2.2 建立BALB/C裸鼠移植瘤模型:收集各組處于對(duì)數(shù)期的 BIU-87+ANG，BIU-87+RI，BIU-87+ANG+RI和BIU-87+空質(zhì)粒組細(xì)胞，PBS重懸并計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量為2×107/ml。裸鼠購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，4～6周齡，體重20±3 g。培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，待長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每只BALB/C裸鼠注射0.1 ml約含2×106個(gè)細(xì)胞，隨時(shí)觀察裸鼠狀態(tài)及實(shí)體瘤形成情況，一個(gè)月后脫頸法處死裸鼠，手術(shù)取出實(shí)體瘤瘤體稱(chēng)量并記錄數(shù)據(jù)。4 g/dl多聚甲醛固定液固定部分實(shí)體瘤組織標(biāo)本和肺樣本，余下部分置于液氮中保存后續(xù)做冰凍切片。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色(HE染色)和免疫組織化學(xué):腫瘤組織用石蠟包埋固定，切片機(jī)4 μm切片，先用二甲苯再用系列梯度乙醇(70，80，90，95，100 ml/dl酒精)脫蠟，流動(dòng)水輕輕沖洗，去出殘余試劑。切片置于蘇木精中染色5 min，流動(dòng)水輕輕沖洗，1 ml/dl鹽酸乙醇分化30 s，流動(dòng)水輕輕沖洗，然后伊紅染色 5 min，系列梯度酒精(70，80，90，95，100 ml/dl酒精)脫水，通過(guò)二甲苯 3次，每次 1 min，最后滴加中性樹(shù)膠，將有細(xì)胞的一面向下固定于載玻片上，顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 免疫組織化學(xué)和免疫熒光:石蠟包埋固定后的腫瘤組織，4 μm切片;60℃恒溫烤箱烘烤30 min脫蠟，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各處理10 min。乙醇梯度脫水5 min，脫水后蒸餾水洗3次，共6 min，用0.3 ml/dl Triton X-100進(jìn)行通透8 min，PBS洗滌3次去除殘留試劑。每組切片用3 ml/dl H2O2溶液和枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH=6.0)抗原修復(fù)處理。37℃恒溫生化培養(yǎng)箱靜置30 min后，滴加一抗 RI，ANG，p-mTOR，p-AKT，p-GSK3β，稀釋比例RI為1∶200，其余均為1∶100，注意將抗體滴在組織樣本處，水平放置于濕盒中4℃過(guò)夜孵育。蘇木素復(fù)染視情況而定，中性樹(shù)膠封片，正置顯微鏡觀察拍照。冰凍切片10 μm切片，固定30 min，室溫自然風(fēng)干，－80℃保存?zhèn)溆谩BS洗滌15 min，0.1 ml/dl Triton X-100通透10 min;5 ml PBS洗滌3次，每次5 min。用3 ml/dl H2O2除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶使其失活;37℃，3 g/dl BSA封閉非特異性位點(diǎn);然后加一抗，CD31 1∶50稀釋?zhuān)琑I 1∶200稀釋?zhuān)每?p-Akt(S473)，p-mTOR，p-GSK 3β(S9)和ANG均1∶100稀釋?zhuān)胖糜跐窈兄?℃孵育過(guò)夜;PBS脫色搖床上洗滌3次，每次10 min。山羊抗兔IgG(Alexa Fluor 594)和山羊抗鼠IgG(Alexa Fluor 488)均1∶100稀釋后，37℃避光孵育1 h;最后用PBS洗滌去除未結(jié)合抗體;滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間的差異分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 共表達(dá)RI與ANG抑制BALB/C裸鼠移植瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及微血管生成 注射各組細(xì)胞的BALB/C裸鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培養(yǎng)7天后有實(shí)體瘤形成，培養(yǎng)一月后脫頸法處死小鼠，手術(shù)取出實(shí)體瘤瘤體并用電子稱(chēng)稱(chēng)重，記錄各組數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，BIU-87+ANG組實(shí)體瘤瘤體重量最重，BIU-87+RI組與BIU-87+ANG+RI組與對(duì)照組相比明顯更輕，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，(圖1AB)。過(guò)表達(dá)ANG表明有更高的肺部轉(zhuǎn)移，但過(guò)表達(dá)RI組與RI和ANG共表達(dá)組肺部轉(zhuǎn)移明顯減少(圖1 C，D)(P＜0.05)。常規(guī)石蠟切片HE染色檢測(cè)血管標(biāo)志物 CD31，BIU-87+ANG組高表達(dá)CD31，BIU-87+RI組CD31信號(hào)較弱，微血管密度比BIU-87+ANG+RI組少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 1E，F(xiàn))。

圖1 共表達(dá)ANG與RI對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和BALB/C裸鼠腫瘤微血管生成的影響

2.2 RI與ANG相互作用影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中磷酸化蛋白水平 免疫組織化學(xué)(IHC)和組織免疫熒光(IF)結(jié)果顯示，BIU87-ANG組熒光強(qiáng)度高，表明p-Akt，p-GSK3β和p-mTOR高表達(dá)。p-Akt和p-PI3K棕染，BIU87+RI組與BIU-87+ANG+RI相比則表達(dá)明顯減弱(圖2A，B)。結(jié)果表明，RI與ANG的相互作用可以調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。

2.3 RI調(diào)控ANG介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路 為了探討RI與ANG相互作用潛在的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中的相關(guān)靶蛋白，使用BIO-RAD軟件進(jìn)行半定量分析結(jié)果表明通路蛋白中非磷酸化蛋白表達(dá)量無(wú)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BIU87+ANG組中p-mTOR，p-PI3K，p-Akt和p-GSK3β 表達(dá)升高，而B(niǎo)IU87+RI組和BIU-87+ANG+RI組表達(dá)下降(圖3A，D)。

3 討論蛋白與蛋白相互作用在生命進(jìn)程中扮演著非常重要的角色。核糖核酸酶抑制因子(RI)屬于酸性胞質(zhì)蛋白，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能致使其成為亮氨酸殘基重復(fù)序列(LRRS)研究的中心蛋白質(zhì)［8］。前期研究表明，RI表現(xiàn)出強(qiáng)烈的腫瘤抑制作用，能抑制某些腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移和腫瘤微血管生成［9，10］。血管生成素(ANG)是一種重要的血管生成因子，在許多癌癥組織中高表達(dá)。在ANG的123個(gè)殘基蛋白質(zhì)中包含許多重要的生物活性位點(diǎn)，比如核轉(zhuǎn)位序列(NLS)、核受體結(jié)合位點(diǎn)、ribonucleolytic活性位點(diǎn)等，此類(lèi)位點(diǎn)可能與ANG的未知生物功能相關(guān)［11］。ANG的重要生物學(xué)功能就是促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，是促進(jìn)體內(nèi)血管生成的潛在因素。ANG可通過(guò)AKT/PI3K/mTOR信號(hào)通路刺激核糖體RNA轉(zhuǎn)錄和核糖體生物合成。ANG在癌癥發(fā)生發(fā)展中的雙重作用表明它將在癌癥治療中發(fā)揮重要作用。

圖2 過(guò)表達(dá)RI調(diào)控ANG促PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路磷酸化作用水平

圖3 過(guò)表達(dá)RI調(diào)控ANG激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路

前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)了過(guò)表達(dá)RI通過(guò)抑制ANG和ILK/PI3K/AKT信號(hào)通路可以抑制黑色素瘤B16細(xì)胞和 B16-F10細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡［12］。隨后發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外上調(diào)RI可以降低通過(guò)ANG引起的p-PI3K，p-AKT，p-GSK-3β和 p-mTOR 蛋白的水平。下調(diào)ANG基因的表達(dá)能顯著抑制膀胱癌移植瘤生長(zhǎng)，并通過(guò)降低 CD31，p-AKT，p-GSK-3β 和 pmTOR表達(dá)抑制膀胱癌BALB/C裸鼠移植瘤增殖及轉(zhuǎn)移的潛能［13］。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞生存［14］。研究表明ANG和AKT通路之間有一個(gè)交互應(yīng)答，ANG可激活A(yù)KT，而AKT的激活又能促進(jìn)ANG的核轉(zhuǎn)位。mTOR作為AKT下游的一個(gè)效應(yīng)器，AKT能直接激活mTOR的磷酸化。ANG誘導(dǎo)AKT的磷酸化形成，該過(guò)程可促進(jìn)傷口愈合和雞胚絨毛尿囊膜血管的生成，ANG不僅能促進(jìn)PKB/AKT磷酸化并激活PKB傳導(dǎo)通路，抑制上皮細(xì)胞凋亡，還能使GSK-3β和mTOR蛋白磷酸化，磷酸化可抑制其作用。本研究通過(guò)RI與ANG的相互作用研究表明，BIU87+ANG組中p-mTOR，p-PI3K，p-Akt和 p-GSK3β表達(dá)升高，而B(niǎo)IU87+RI組和BIU-87+ANG+RI組表達(dá)下降，證實(shí)其相互作用能通過(guò)降低信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化蛋白的表達(dá)來(lái)抑制膀胱癌BIU87細(xì)胞增殖和血管的形成，抑制BALB/C裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步研究RI與ANG相互作用在膀胱癌中的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。