李騰達，劉 鵬，龍曙萍，劉 云，黃元蘭，張薇薇，郭 杰，谷明莉，鄧安梅

(1.第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上海 200433;2.解放軍455醫(yī)院，上海 200052)

新生隱球菌是一種普遍存在的機會性致病真菌，其常侵犯免疫力低下的人群如HIV感染者、肝癌患者等造成病人的肺部或腦膜感染［1］。目前診斷隱球菌腦膜炎的方法中印度墨汁染色法在腦脊液真菌量小于1000 CFU/ml時靈敏度顯著下降，易漏診早期病患;真菌培養(yǎng)至少需1周時間才能得到可靠結果，結果的主觀影響因素較大;病理學方法是隱球菌腦膜炎的確診性實驗，但其取樣困難，易與免疫缺陷造成的假性肉芽腫混淆［1］?；诂F(xiàn)有隱球菌腦膜炎的診斷狀況，發(fā)展一種高靈敏度和相對特異度的檢測手段，對于該病的早期診斷、提高病人術后預后有重要意義。

表面增強拉曼光譜技術(surface-enhanced raman scattering technology，SERS)是一種由于非規(guī)則檢測表面等離子激活致電磁場變化而產(chǎn)生的增強拉曼信號技術，具有靈敏度高、檢測限低等特點［2］。隨著外泌體等液態(tài)活檢技術的興起，SERS亦被用于該領域的檢測，研究表明SERS技術可動態(tài)觀察SKOV3細胞系來源外泌體在干燥過程中內(nèi)容物的變化［3］，亦可用于對結腸癌細胞系和健康細胞來源的外泌體進行定性和定量［4］，該類研究證明了SERS用于外泌體檢測具有靈敏度高等優(yōu)勢。為進一步提高隱球菌腦膜炎檢測的特異度，本實驗結合前期對CD93+外泌體在隱球菌腦膜炎血清中顯著增高的研究發(fā)現(xiàn)，利用SERS技術對其進行高靈敏度檢測，以優(yōu)化隱球菌腦膜炎的疾病檢測手段，輔助臨床對該病的診斷。

1 材料和方法

1.1 研究對象 以38例2013年12月～2017年3月在上海長海醫(yī)院和長征醫(yī)院確診的隱球菌腦膜炎患者血清作為實驗組，診斷標準為腦脊液染色新生隱球菌陽性或培養(yǎng)陽性，患者男性14例，女性24例，中位年齡為39.7±6.3歲。健康對照組為同期體檢的38例血清標本，男女比例為8∶11，中位年齡為40.1±6.7歲，實驗組與對照組年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院醫(yī)學科研倫理委員會批準，所有受試對象均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 抗體(美國 Abcam公司)，HAuCl4·3H2O及對氨基巰苯酚(PATP)等(美國Sigma-Aldrich公司)，SM3-P100磁珠(Alrun Nano Science＆Technology公司)，ELISA試劑盒(Thermo公司)，超速離心機(HITACHI公司)，拉曼光譜儀(法國Horiba Jobin Yvon公司)，納米顆粒追蹤分析儀 (英國Malvern Company)。

1.3 方法

1.3.1 受試對象血清收集:將研究對象非抗凝血于采集后1～2 h內(nèi)進行2500×g，10 min分離，或置于室溫自然擱置形成血清，將形成的血清于－80℃保存待用。

1.3.2 血清外泌體的分離:將患者血清經(jīng)0.2 μm過濾器過濾，用PBS稀釋到適合濃度后于2000×g，離心20 min，收集上清，經(jīng)0.2 μm 過濾器過濾，于120000×g，離心3 h，收集沉淀，用PBS重懸后重復離心后再次收集沉淀，以PBS重懸待測。

1.3.3 納米追蹤分析進行外泌體定量:將待檢測的外泌體用PBS稀釋到適宜濃度，經(jīng)0.22 μm過濾器過濾，取1 ml進行外泌體定量，儀器相關參數(shù):激光為Blue 488，檢測閾值為3，溫度為22.9℃～23.1℃。實驗重復五次，取均值計算小于200 nm的外泌體的濃度。

1.3.4 SERS探針的合成及檢測前樣品制備:用傳統(tǒng)的Fren’s方法合成16 nm金納米顆粒約600 μl，在該體系中加入 100 μl Tris-HCl(50 mmol/L/，pH8.5)，100 μl 50 μmol/L PATP 水溶液，1 mg/dl BSA溶液反應30 min后進行離心(6000 r/min，20 min)分離沉淀，用PBS重懸，加入抗體孵育2 h將抗體連接到材料上。每個血清標本分離得到的外泌體溶液取20 μl，利用磁珠連接的抗體進行捕獲，捕獲得到的外泌體用以上相應抗體標記的材料進行標記及SERS信號檢測。

1.3.5 ELISA試劑盒檢測細胞因子:按照ELISA試劑盒操作說明檢測血清中TNF-α，IFN-γ等因子的表達情況。

1.4 統(tǒng)計學分析 本研究中兩連續(xù)計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗，兩變量之間的相關性用Pearson系數(shù)表示，檢驗水準α為0.05，線性擬合采用 Origin軟件進行，統(tǒng)計分析軟件為 Graph Prism 6.0。

2 結果

2.1 兩組間血清外泌體表面蛋白SERS檢測信號的比較 首先在10例實驗組與10例對照組血清外泌體中檢測CD93，CD9及CD63等外泌體表面蛋白的SERS信號，結果顯示以CD93為靶點的SERS信號在實驗組與對照組血清外泌體中分別為3789.45±267.76 vs 676.98±107.76，差異具有統(tǒng)計學意義(t=34.10，P＜0.0001)。而CD9在實驗組與對照組 SERS信號強度分別為 1563.78±432.98 vs 1478.09±488.17(t=0.4153，P=0.6828)，CD63 分別為 2193.53±298.06 vs 1987.93±301.87(t=1.533，P=0.1428)，差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 兩組間血清外泌體表面蛋白SERS檢測信號的比較

2.2 SERS檢測實驗組血清CD93+外泌體的標準曲線 取三例實驗組血清約2 ml進行外泌體分離，用nanosight對外泌體原始溶液濃度進行定量，調(diào)整其濃度均為5.50×108個/ml。以抗 CD93抗體標記的納米材料對實驗組不同濃度的外泌體進行標記，并觀測其SERS信號。將外泌體濃度與SERS信號強度分別取對數(shù)值后進行相關性分析，結果顯示，隨著外泌體濃度的增加，SERS信號亦增加，線性擬合方程為Y=(1.3186±0.0501)+(0.2765±0.00788)X，差異具有統(tǒng)計學意義(R=0.99596，P＜0.0001)。最低檢測的外泌體濃度為5500個/ml，本實驗滴加的稀釋液為20 μl，故其最低檢測限的外泌體約為110個/ml，見圖2。

圖2 SERS檢測實驗組血清CD93+外泌體的標準曲線

2.3 實驗組與對照組血清CD93+外泌體的log(SERS信號) 利用該體系檢測38例實驗組與對照組血清CD93+外泌體的SERS信號，并取對數(shù)值。實驗組為 2.75±0.59，對照組為 2.47±0.15，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.835，P=0.0059)。

2.4 該檢測方法與ELISA法的相關性分析 用傳統(tǒng)ELISA法檢測實驗組血清中IFN-γ與TNF-α的結果分別為 209.54±56.90 pg/ml，468.98±102.76 pg/ml。拉曼光譜儀檢測實驗組血清中納米材料標記的CD93+外泌體的log(SERS信號)值與ELISA檢測得到的IFN-γ，TNF-α結果進行相關性分析，結果表明該檢測方法得到的結果與IFN-γ，TNF-α的ELISA結果呈正相關，差異具有統(tǒng)計學意義(r=0.389，0.478，P＜0.05)。

3 討論新生隱球菌是一種廣泛分布于外界環(huán)境的哺乳動物機會性致病菌，在人體免疫力低下時，其可侵入人體致病人顱腦感染，形成隱球菌腦膜炎［5］。目前輔助隱球菌腦膜炎診斷的方法有染色法、影像學、分子診斷技術以及病理組織學檢查等，但此類方法亦存在一些不足:如印度墨汁染色法對于真菌負荷小于1000 CFU/ml的情況，其靈敏度會顯著下降;CT及MRI等影像學方法較難發(fā)現(xiàn)隱球菌腦膜炎顱腦部病變早期病灶;PCR等分子生物學方法檢測時間長(2～3天)，需專業(yè)人員操作;腦脊液乳膠凝集實驗在類風濕因子存在的情況下會出現(xiàn)假陽性結果，難以區(qū)分死亡病菌與活菌;病理組織學方法取樣困難，對患者顱腦損傷大，易與免疫缺陷造成的假性肉芽腫混淆;LFA雖然相比較于傳統(tǒng)檢測手段其靈敏度和特異度有所提高，但其檢測限有待進一步提高［1］?，F(xiàn)有檢測方法的不完善使得隱球菌腦膜炎發(fā)現(xiàn)時間延后，造成患者預后差，因此發(fā)展一種靈敏度高、檢測時間短、特異度較高的隱球菌腦膜炎檢測方法具有重要意義。外泌體是一種胞外囊泡，高表達CD9，CD63等分子，直徑50～180 nm，被視為細胞的“指紋印記”，其可由一種細胞分泌后作用于臨近細胞影響其功能的表達，亦可隨血液、淋巴液等作用于遠端臟器，是一種頗具價值的疾病監(jiān)測指標［6，7］。近來有報道稱SERS技術可檢測SKOV3細胞系來源的外泌體，并且可以在單個外泌體層面上對其干燥過程中內(nèi)容物的變化進行監(jiān)測［3］;亦有研究表明利用金納米顆粒對紅細胞和膠質瘤細胞來源的外泌體進行標記，得到的外泌體溶液具有很好的單分散性、均一性，有利于實現(xiàn)對外泌體良好的觀測［6］。本課題前期對隱球菌腦膜炎外周循環(huán)外泌體的研究表明，CD93+外泌體在患者血清中表達豐富，且與疾病發(fā)生發(fā)展可能存在相關性，基于此，我們以外泌體CD93為標志物并結合SERS技術對隱球菌腦膜炎血清中的外泌體進行檢測，結果表明SERS能夠檢測到的外泌體的最低量為110個/ml，隱球菌腦膜炎患者血清用量為20 μl，相比較于傳統(tǒng)的 ELISA檢測法顯著降低了臨床標本用量，進一步對不同濃度的實驗組血清CD93+外泌體進行檢測，結果表明log(SERS信號)與log(外泌體濃度)有較好的線性關系，且該方法檢測實驗組血清標本的結果與ELISA試劑盒檢測的TNF-α，IFN-γ結果呈正相關，這就為其應用于臨床研究奠定了理論基礎。但本實驗標本量有待進一步擴大，SERS檢測體系有待進一步優(yōu)化以降低檢測限，實現(xiàn)微量檢測和無創(chuàng)液態(tài)活檢，從而減輕病理診斷給患者造成的痛苦。