金秀華，李艷冬

(1.赤峰市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古赤峰 024000;2.赤峰市紅山區(qū)婦幼保健所檢驗科，內(nèi)蒙古赤峰 024000)

由于哮喘的發(fā)生與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，近年來發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，這與全球工業(yè)化進(jìn)程加速及人們對遺傳性疾病的認(rèn)識不斷深入密不可分［1］。我國16城市兒童哮喘患病率逐年升高，較20年前上升了147.9%，并且哮喘發(fā)病年齡也有逐年降低的趨勢［2］。自從2001年新的基因T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白域(T cell immunoglobulin domain and mucin domain TIM)基因家族在小鼠11號染色體被McIntire等［3］人發(fā)現(xiàn)后，其基因家族包括:Tim-1，Tim-3和Tim-4，以往的研究發(fā)現(xiàn)哮喘的主要遺傳易感位點就在此區(qū)域。隨著近年來精準(zhǔn)醫(yī)療的興起及基因測序的普及和費(fèi)用的降低，Tim-3基因多態(tài)性與漢族人群哮喘的研究有多篇報道，但尚未見Tim-3基因多態(tài)性與我國蒙古族人群哮喘的報道。本研究選取Tim-3基因啟動子區(qū)一個多態(tài)性位點-1516G/T(Rs10053538)和外顯子區(qū)兩個多態(tài) 性位 點-882C/T(Rs4704853)，-574T/G(Rs1051746)，研究其與蒙古族兒童哮喘的關(guān)系，以期為蒙古族兒童哮喘的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 哮喘組為2014年6月～2016年12月在赤峰市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院和赤峰市紅山區(qū)婦幼保健所門診及住院的2～15歲蒙古族哮喘兒童129例(女57例，男72例)，平均年齡6.2歲;對照組為同期無哮喘等變應(yīng)性疾病來院健康體檢的蒙古族兒童130例(女55例，男75例)，平均年齡6.0歲。哮喘組兒童選擇標(biāo)準(zhǔn)符合中國支氣管哮喘防治指南(基層版)中支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。對照組選擇標(biāo)準(zhǔn)如下:①無心血管疾病及其他慢性疾病;②無變應(yīng)性哮喘、過敏性鼻炎、濕疹等變應(yīng)性病史。本研究獲得紅山區(qū)婦幼保健所及赤峰市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會和兒童家長的知情同意。

1.2 試劑及儀器 蛋白酶K購自美國Sigma，提取DNA采用OMEGA公司的專用DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TMSEBlood DNA Kit)，DNA聚合酶選擇大連寶生物高保真TaKaRa的Blood Genome DNA Extraction Kit進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工合成，限制性內(nèi)切酶選自Fermentas公司，溴化乙錠(EB)購自美國Promega公司，紫外分光光度儀DU 640購自美國Beckman公司。

1.3 方法 所有研究對象抽取靜脈血2 ml以上，EDTA抗凝管存貯，取白細(xì)胞集中的中間層采用蛋白酶K進(jìn)行處理后，用DNA提取試劑盒提取DNA后，－20℃冰箱編號并分類保存。選取GenBank中Tim-3基因啟動子區(qū)三個多態(tài)性位點Rs10053538，Rs4704853，Rs1051746。引物合成參照朱圣韜等［5］的研究報道。對Tim-3基因三個多態(tài)性位點采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法(PCRRFLP)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反映總體系 50 μl，包括50ng 的 DNA 模板，1 mmol/L MgSO4，0.2 μmol/L各個引物，0.2 mmol/L的 dNTPs，1U的 TaKaRa DNA聚合酶和10×PCR緩沖液5 μl。PCR循環(huán)情況包括最初預(yù)變性 94℃3 min，94℃變性 30 s，Rs10053538，Rs4704853和Rs1051746位點 35 s退火溫度分別是60℃，55℃，60℃和72℃延長40 s，共30個循環(huán)。72℃延長10 min。酶切后采用1.8 ml/dl的瓊脂糖電泳和溴化乙錠(EB)染色后，在紫外燈下依據(jù)酶切結(jié)果分型。具體限制性內(nèi)切酶及酶切產(chǎn)物，見表1。

表1 TIM-3基因多態(tài)性引物設(shè)計及酶切產(chǎn)物

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Arlequin統(tǒng)計軟件對哮喘組和對照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(P＞0.05，表示符合哈-溫平衡)。采用 Fisherχ2檢驗(SPSS17.0)分析兩組間基因型和等位基因之間的差異，并計算哮喘遺傳多態(tài)性的風(fēng)險(OR)和95%的可信區(qū)間(CI)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果Tim-3基因在兩組間基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，群體具有代表性。哮喘組Rs1051746位點基因多態(tài)性的基因型和等位基因頻率與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，哮喘組Rs1051746位點的T等位基因頻率(12%)明顯高于對照組(3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.239，95%CI 0.067～0.858，P＜0.05)，見表 2。

表2 Ti m-3基因三種多態(tài)性位點在兩組間基因型、等位基因分布

3 討論現(xiàn)代醫(yī)學(xué)可以完全控制哮喘急性發(fā)作時的癥狀，但尚無法根治哮喘，其易反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響患兒的正常生活、學(xué)習(xí)及生長發(fā)育，最終增加家庭及整個社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。兒童哮喘的患病率逐年呈增長的趨勢已經(jīng)成為公認(rèn)的事情，與赤峰市在地理位置和人口結(jié)構(gòu)上較為相似的包頭，0～14歲兒童哮喘的患病率從1990年最初調(diào)查的0.37%已經(jīng)上升到2010年調(diào)查時的0.90%，哮喘的患病率在20年間幾乎上漲了3倍［2］，這說明了內(nèi)蒙古地區(qū)兒童哮喘的患病率也不容忽視。此次選取Tim-3三個基因多態(tài)性位點研究與蒙古族兒童哮喘的關(guān)系，以期從遺傳學(xué)的角度，對蒙古族兒童哮喘的發(fā)病提供參考。Tim-3基因在人類由301個氨基酸組成，全長約23kb，是具有基序的I型膜蛋白。在Tim-3基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)有基因多態(tài)性的存在，其與機(jī)體對某些免疫性疾病的耐受性和易感性有關(guān)［5］。Tim-3分子對Th1細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)作用，主要表達(dá)在終末期的Th1表面。本研究發(fā)現(xiàn)Tim-3基因Rs1051746多態(tài)性位點與蒙古族兒童哮喘有關(guān)。2004年Chae等［7］在韓國人群中研究發(fā)現(xiàn)Tim-3基因外顯子區(qū)-574T/G(Rs1051746)多態(tài)性位點與成人過敏性鼻炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和哮喘相關(guān)。隨后，我國學(xué)者巫學(xué)蘭等［8］人在湖北地區(qū)兒童及成人均證實Tim-3基因-574T/G多態(tài)性位點與哮喘有關(guān)。吳立強(qiáng)等［9］人運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性檢測Tim-3基因多態(tài)性位點，對重慶地區(qū)200例兒童咳嗽變異性哮喘患兒采用病例對照研究發(fā)現(xiàn):Tim-3基因外顯子區(qū)的-574T/G(Rs1051746)多態(tài)性位點與兒童咳嗽變異性哮喘易感性有關(guān)，其攜帶T-C-G單體型的人群罹患咳嗽變異性哮喘的風(fēng)險也較高。我們的研究證實Tim-3基因外顯子區(qū)-574T/G(Rs1051746)位點與蒙古族兒童哮喘有關(guān)。以上研究均證實Tim-3基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性有關(guān)。梁濤等［10］對采用病例對照研究對60例哮喘急性發(fā)作者檢測外周血Tim-3 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)其明顯高于對照組，提示Tim-3基因多態(tài)性可能影響了Tim-3的表達(dá)，最終參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展。

雖然本研究證實Tim-3基因外顯子區(qū)-574T/G(Rs1051746)位點與蒙古族兒童哮喘有關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)大樣本、多中心的研究結(jié)果支持。期待以后能有更多的有關(guān)各民族基因遺傳方面的研究，為我國這樣一個多民族國家疾病防治提供參考。