王鑫鑫， 張 燕， 朱敬麗， 路趙碩， 姚 健， 王德才， 陳小貝

(哈爾濱醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，黑龍江 哈爾濱 150081)

乙酸在醫(yī)藥、農業(yè)、合成纖維和印染等方面有廣泛的應用，國內外市場的需求量不斷增長[1]。我國是目前世界上最大的乙酸生產國，主要采用甲醇羰基合成技術，但是在原材料、催化劑性能及成本控制等方面與國外企業(yè)相比都存在很大的差距。目前國內外發(fā)現了制備乙酸新途徑，有二氧化碳轉化法和生物法[2]。檸檬酸是世界第二大發(fā)酵產品，產量僅次于酒精的產量[3]，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化學工業(yè)等方面。檸檬酸的生產方法有深層液體發(fā)酵法和固體發(fā)酵法，近年來我國采用黑曲霉檸檬酸高產菌株進行深層液體發(fā)酵方法，成為國際領先的生產技術，我國的檸檬酸產量和貿易均居世界第一位[4-5]，但在微生物發(fā)酵方法中仍有一定的發(fā)展?jié)摿?。小RNA(Small RNA，sRNA)是一種存在于細菌中的、長度為50～300個核苷酸左右的調節(jié)性RNA。在大腸埃希菌中首次發(fā)現了sRNA 6SRNA[6]，至今為止在大腸埃希菌中已經發(fā)現了80～100個sRNA，除廣泛分布于大腸埃希菌中外，還分布于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等細菌中[7]。研究發(fā)現sRNA參與調控很多生物過程，它們既可以通過與其靶mRNA進行不完全堿基互補配對來發(fā)揮調節(jié)作用[8-10]，也可以與通過模仿其他氨基酸的二級結構來調節(jié)相應蛋白活性[11-12]。近年來發(fā)現，由sRNA組成的轉錄后調控網絡，在轉錄后水平發(fā)揮調節(jié)作用的RNA，對細菌存活、代謝、致病性和耐藥性具有調節(jié)作用。GLmZ是一種常見的sRNA，研究發(fā)現，yhbJ基因可以負反饋調節(jié)GLmZ的表達，即yhbJ基因缺陷使GLmZ濃度增加。GLmZ激活glmS mRNA的表達來降低葡萄糖胺-6-磷酸酶(glucosamine-6-phosphate synthase，GLmS)的表達，從而調控葡萄糖胺-6-磷酸(glucosamine-6-phosphate，GlcN-6-P)的濃度[14-15]。GlcN-6-P濃度的變化還可以反饋調節(jié)GLmZ的表達[14]，從而使細胞體內GlcN-6-P濃度保持在較為穩(wěn)定的水平。有研究顯示，GLmZ還可以調節(jié)細胞壁的形成，通過調節(jié)glmS mRNA促使細胞合成氨基糖，氨基糖是細胞合成細胞壁的重要啟動子[15]。 但是GLmZ作為近年來一種新發(fā)現的sRNA，目前對GLmZ作用機制的研究和應用較少，仍有較大的發(fā)展?jié)摿?。在生物體內，乙酸可以生成乙酰CoA，乙酰CoA和草酰乙酸縮合不可逆地生成檸檬酸，此反應是三羧酸循環(huán)的第一個生化反應[16]。由于sRNA可能對細胞代謝產生影響，由此推測GLmZ在大腸埃希菌中的表達可能會對其代謝過程和代謝產物產生一定的影響，因此，本文研究sRNA GLmZ對細菌代謝乙酸和檸檬酸的影響，為工業(yè)生產乙酸和檸檬酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 大腸埃希菌(E.coli)M15菌株、轉染空質粒的E.coliM15菌株、轉染sRNA GLmZ質粒的E.coliM15菌株，均由哈爾濱醫(yī)科大學基礎學院微生物教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 三種細菌均用LB培養(yǎng)基，其中E.coliM15的培養(yǎng)基內添加50 μg/mL Kan，轉染空質粒的E.coliM15和轉染GLmZ質粒的E.coliM15的培養(yǎng)基內添加50 μg/mL Kanamycin(卡那霉素)和100 μg/mL Ampicillin(氨芐青霉素)。

1.1.3 試劑及儀器 高效液相色譜Agilent Technologies 1260 Infinity(美國Agilent公司)，COSMOSIL C18-AR-Ⅱ色譜柱(4.6 mm×250 mm，美國Agilent公司)。實驗用水為經過milli-Q純水儀的超純水，乙酸和檸檬酸兩種標準品為國家藥品標準物質。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)條件及其處理 接種30 μL菌液于3 mL LB培養(yǎng)基中，水浴振蕩器內37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)。各細菌分別培養(yǎng)至2、4、6、8、10、12、14、16、18 h取出，設置接種細菌的LB培養(yǎng)基為實驗組，LB培養(yǎng)基為空白對照組。

1.2.2 樣品前處理 在菌液中加入5 mL 80%的乙醇，勻漿1 min，3 000 r/min、10 min、4 ℃離心收集上清液，轉入培養(yǎng)皿，殘渣再分別用3、2 mL 80%的乙醇洗滌2次，離心條件同上，合并上清液。70 ℃恒溫水浴蒸去乙醇，殘留物用超純水定容至2 mL，充分搖勻，取部分樣液經0.45 μm濾膜過濾待用。

1.2.3 標準溶液的配制 將各有機酸標準品稀釋，配制有機酸標準品混合溶液：乙酸0.2%和檸檬酸1.32 mg/mL。

1.2.4 流動相及流速的優(yōu)化 以C18色譜柱為分析柱，采用5種不同的流動相對2種標準有機酸混合溶液進樣進行試驗驗證：A為3%CH3OH-0.05 mol/L Na2HPO4、B為0.01 mol/L H2SO4、C為3%CH3OH-0.05 mol/L KH2PO4、D為0.01 mol/L K2HPO4、E為0.01 mol/L (NH)4HPO4。

1.2.5 柱溫及波長 有機酸溶液在流動相的解離過程中隨溫度的升高而增加，使有機酸的分離效果變差，分別選用柱溫20、30和40 ℃進行試驗。

1.2.6 數據處理 用上述方法對三種細菌菌液中的有機酸含量進行測定分析，分別進行6次平行試驗。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，采用重復測量方差分析方法，對交互效應顯著的數據進行簡單效應檢驗[17]，再應用OriginProPorable 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件

結果表明流動相A導致目標有機酸出現雜峰，分離效果較差；流動相B和流動相D未出峰；C為流動相時，標準有機酸出峰時間提前且集中；流動相為E時有機酸，峰形對稱，窄且尖銳，無毛刺無拖尾，基線無漂移，故選擇用E為流動相。用1 mol/L磷酸分別調節(jié)流動相pH為2.5、2.7和3.0，當pH值為2. 7時出峰效果較好。分別設置流速為0.5、0.8、1.0、1.2 mL/min，發(fā)現流速為0.5和0.8 mL/min時，峰形較寬；流速為1.2 mL/min時，出現拖尾現象；流速為1.0 mL/min時峰形尖銳，無拖尾現象，且響應值較高，故選用1.0 mL/min的流速。柱溫試驗發(fā)現30 ℃作為分離柱溫時，分離效果較好，響應值較高，故選用30 ℃為柱溫。經試驗，選用紫外檢測器波長為215 nm。

2.2 有機酸標準圖譜和樣品中有機酸色譜圖

應用已確定的高效液相色譜條件對乙酸、檸檬酸標準有機酸混合溶液和實驗樣品中有機酸進樣，色譜圖見圖1。

圖1 有機酸標準品和樣品的色譜圖Fig.1 Standard organic acid products and sample chromatogramA：HPLC測定標準品乙酸和檸檬酸色譜圖；B：E.coli M15實驗組樣品色譜圖；1：乙酸；2：檸檬酸A：HPLC determination of standard acetic acid and citric acid chromatogram； B：E.coli M15 experimental group chromatogram；1：acetic acid；2：citric acid

2.3 有機酸標準曲線的繪制

將不同濃度的兩種有機酸標準溶液由低濃度向高濃度進樣，以峰面積作縱坐標，相應有機酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標制作標準曲線，通過Excel計算回歸方程及相關系數(見表1)，相關系數分別為0.999 5和0.996 6，說明標準曲線的擬合程度較好。

表1 兩種有機酸的線性回歸方程、相關系數、檢出限和線性范圍

2.4 有機酸測量精確度實驗

隨機選擇某一生長時間的細菌作為對象，在相同條件下，一天內重復進樣6次并連續(xù)進樣6 d，結果見表2。各有機酸的日內重復性均小于2.97%，日間重復性均小于3.26%，說明儀器的性能較好，測量數據可靠。

表2 有機酸的日內重復性和日間重復性

2.5 有機酸測量準確度實驗

根據有機酸的回收率可以考查有機酸測定方法的準確度，測定結果見表3，乙酸和檸檬酸的平均回收率分別為88.5%、95.9%，說明有機酸測量方法的回收率高、準確度好。

表3 有機酸的回收率

2.6 細菌生長曲線

將3種細菌各生長時間段的菌液搖勻，用麥氏比濁管進行對比測定細菌含量，各時間段細菌進行6次平行試驗，計算均值繪制細菌生長曲線，見圖2。由圖2看出，3種細菌在生長遲緩期的差異較小，E.coliM15和E.coliM15 GLmZ在生長對數期差異較明顯，而E.coliM15空質粒的對數期與遲緩期的區(qū)分度較小；在生長對數期中，E.coliM15 GLmZ實驗組細菌比E.coliM15實驗組細菌生長減緩，在培養(yǎng)至12 h和14 h有顯著差異(P<0.05)?？傮w上，E.coliM15最先進入生長對數期和穩(wěn)定期，生長速度最快，E.coliM15空質粒生長速度次之，E.coliM15 GLmZ生長速度最慢。

2.7 LB培養(yǎng)基空白對照組中有機酸含量

LB培養(yǎng)基空白對照組中乙酸含量(分別設置為LB培養(yǎng)基-1、LB培養(yǎng)基-2、LB培養(yǎng)基-3)隨時間的延長變化幅度較小。重復測量方差分析結果表明，LB培養(yǎng)基與培養(yǎng)時間的交互作用(F=0.230，P>0.05)對乙酸含量的影響不顯著；時間因素(F=0.789，P>0.05)和不同LB培養(yǎng)基因素(F=0.484，P>0.05)的主效應均不顯著，即不同時間段的乙酸含量的變化無統(tǒng)計學差異，故后續(xù)試驗中將空白對照組中各時間段乙酸含量視為定值，即均值0.886 6 mg/mL。檸檬酸含量經統(tǒng)計分析無交互效應(F=1.839，P>0.05)和主效應(F=1.149，P>0.05)，定值為4.808 6 mg/mL，具體統(tǒng)計結果不在此贅述。

圖2 三種大腸埃希菌的生長曲線Fig.2 The growth curves of three kinds of Escherichia coli*P<0. 05 E.coli M15與E.coli M15 GLmZ相比*P<0.05 compare E.coli M15 to E.coli M15 GLmZ

2.8 三種細菌各培養(yǎng)時間中有機酸代謝含量的測定與比較

由于LB培養(yǎng)基中含有一定量的上述兩種有機酸，考查菌株各生長時期代謝的有機酸量時，需扣除培養(yǎng)基中有機酸底值。當代謝量為負時，表明菌株生長代謝過程中消耗的有機酸量大于其代謝的有機酸量；為正值時，說明菌株在生長代謝過程中代謝產生的有機酸量大于其消耗的有機酸量。

有機酸含量=實驗組有機酸-空白對照組有機酸=細菌代謝的有機酸-細菌吸收的有機酸。

2.8.1 三種細菌在不同培養(yǎng)時間中乙酸含量的比較 重復測量方差分析結果見表4，表明時間因素和三種細菌之間的交互作用(F=36.406，P<0.05)對細菌產生乙酸的影響顯著。三種細菌效應中，E.coliM15和E.coliM15 空質粒隨培養(yǎng)時間的延長，產生乙酸量均有顯著性差異(P<0.01)。由其趨勢圖圖3看出，E.coliM15的乙酸代謝量先逐漸增加后降低，最后趨于平衡；E.coli空質粒代謝的乙酸量隨培養(yǎng)時間的延長呈現不斷增長的趨勢；E.coliM15 GLmZ的乙酸代謝量在各培養(yǎng)時間均為負值，說明消耗的富馬酸較多。經簡單效應檢驗，E.coliM15和E.coliM15空質粒在各時間段代謝產生的乙酸均有顯著差異(P<0.05)。

表4 不同培養(yǎng)時間和不同菌種對細菌代謝乙酸的影響

注：*表示主效應的F統(tǒng)計量和P值；a表示在相同生長時間點上與E.coliM15比較P<0.05；# 表示交互效應的F統(tǒng)計量和P值；“-”表示未檢測到該有機酸

圖3 三種大腸埃希菌代謝的乙酸量變化趨勢Fig.3 Acetic acid content of 3 kinds of E. coli

圖4 三種大腸埃希菌代謝的檸檬酸量Fig.4 Citric acid content of 3 kinds of E. coli

2.8.2 三種細菌在不同培養(yǎng)時間中產生檸檬酸含量的比較 重復測量方差分析結果見表5，時間因素和不同菌種之間的交互效應(F=9.928，P<0.01)顯著；三種細菌的時間效應顯著(F=13. 6，P<0.01)，其中E.coliM15(F=0.607，P>0.05)代謝的檸檬酸量隨培養(yǎng)時間的延長無顯著差異。E.coliM15空質粒代謝的檸檬酸量穩(wěn)定在(-1.969 4 ± 0.201 9) mg/mL范圍內。圖4結果表明，E.coliM15 GLmZ代謝的檸檬酸含量隨細菌培養(yǎng)時間的延長呈先增加后逐漸穩(wěn)定的趨勢，均為正值，說明其代謝產生的檸檬酸較多。經簡單效應檢驗，在各時間點上，E.coliM15和E.coliM15 GLmZ代謝的檸檬酸量均存在顯著差異(P<0.05)。

表5 不同培養(yǎng)時間和不同菌種對細菌代謝檸檬酸的影響

注：*表示主效應的F統(tǒng)計量和P值；交互效應的F統(tǒng)計量為8.014和P值為0.000；b：在相同培養(yǎng)時間點上，與E.coliM15空質粒比較，P<0.05

3 討 論

本研究發(fā)現，質粒對大腸埃希菌的生長有較大的影響，質粒越大，細菌的生長速度越慢，因為質粒作為一種環(huán)狀DNA分子，可以參與細菌的代謝，需要消耗一定量的有機酸，這就與細菌生長所需有機酸形成競爭關系，從而降低細菌的生長速度，這與劉義等[18]的研究結果一致。另外，本研究中轉染空質粒的E.coliM15實驗組和E.coliM15 GLmZ實驗組細菌生長減緩，但是兩者間細菌數量沒有明顯差別，說明這些細菌之間代謝產生乙酸、檸檬酸的含量差異是由于細菌代謝能力變化所致，可以排除不同實驗組細菌數量差異的誤差干擾，結果可信。

研究發(fā)現空質?？梢源龠M乙酸的合成。轉染sRNA GLmZ質粒的E.coliM15代謝產生的乙酸量降低且隨培養(yǎng)時間的延長無顯著變化，這可能是sRNA GLmZ質?？梢砸种埔宜岬暮铣苫蛘叽龠M乙酸的代謝。我國是目前世界上最大的乙酸生產國，但是在原材料方面與國外還有很大的差距，多采用煤制甲醇工藝，成本較高，不具有競爭優(yōu)勢，因此技術創(chuàng)新顯得尤為重要。E.coliM15空質粒具有遺傳背景清楚、營養(yǎng)簡單和易培養(yǎng)的特點，利用發(fā)酵工程技術以E.coliM15空質粒為菌株生產乙酸為工業(yè)生產乙酸提供了參考。

轉染sRNA GLmZ質粒的E.coliM15在穩(wěn)定期后期和衰亡期代謝產生的檸檬酸量略有下降，此時對檸檬酸的合成減少，且作為菌株利用效能較高的碳源被重新攝入菌體內利用所致[19]。轉染sRNA GLmZ質粒的E.coliM15代謝的檸檬酸量顯著高于E.coliM15菌株代謝的檸檬酸量，這為改進工業(yè)生產檸檬酸提供了新思路。目前，我國是檸檬酸產量最大的國家，利用黑曲霉作為生產菌株已經達到了較高的水平[20]，但是將sRNA GLmZ質粒轉染到黑曲霉菌株中為提高檸檬酸的產量提供思路。