汪 燕，石海春，余學杰，趙長云，柯永培，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，四川 成都 611130； 2.貴州師范大學 植物遺傳育種研究所 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001； 3.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責任公司，四川 成都 610213)

利用輻射誘變創(chuàng)制突變體庫是解析植物基因功能的有效手段之一。目前，利用60Co-γ射線在植物中已經(jīng)選育出大量不同類型的突變體，如早熟、矮稈、抗倒伏、抗病、高蛋白和高油脂含量、雄性不育等有實用價值的突變體[1-2]；其中，雄性不育突變體在雜種優(yōu)勢利用、植株生殖發(fā)育與遺傳特性研究中具有重要意義。本課題組前期利用60Co-γ射線誘變篩選得到1個玉米雄性不育突變體K305malesterility(K305ms)，該突變體不育性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，花粉敗育徹底，在花粉母細胞時期不育花粉外形開始表現(xiàn)異常，至小孢子時期單核小孢子完全皺縮，停止發(fā)育，直至分解[3]；該性狀受單個隱性核基因控制[4]；不育植株在農(nóng)藝性狀及其配合力和產(chǎn)量方面與同群體內(nèi)的可育株K305 fertility(K305F)無明顯差異[5]。本試驗通過對K305ms與K305F生理代謝等指標進行比較研究，以期明確K305ms花粉敗育過程中的物質(zhì)代謝和抗氧化代謝的特點，為后續(xù)研究與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以玉米雄性不育突變體K305ms為母本，與同群體內(nèi)可育植株K305F進行姊妹交，以該姊妹交群體為試驗材料，實驗材料均由四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責任公司提供。2012年4月，將來源于同一個果穗的K305ms姊妹交群體種植于四川省成都市雙流縣基地，共378顆種子，直播不間苗，田間進行精細管理，幼苗期對每個單株掛牌并統(tǒng)計存活株數(shù)。最終存活358株，用于本試驗中物質(zhì)含量和酶活性的測定。

1.2 試驗方法

玉米抽雄穗前將植株進行單株標記。根據(jù)植株外形特征和雄穗的大小，分別取花粉母細胞時期(Ⅰ)、四分體時期(Ⅱ)、小孢子時期(Ⅲ)和成熟時期(Ⅳ)的花藥，每次僅選取雄穗的中部小穗，避免傷害其余部分小穗，讓其繼續(xù)生長至成熟期，田間鑒定該植株的雄花育性。將所取雄花的穎殼和花藥分離，并對首尾兩端的花藥進行顯微觀察以確定所在的時期。若小穗首尾兩端花藥發(fā)育階段均相同，則視為發(fā)育時期一致。將3～5穗同一發(fā)育時期的花藥和穎殼分別混合收集于離心管中，儲存于-80 ℃冰箱，供物質(zhì)含量與代謝酶活性的測定。

采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[6]；茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT))和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性的測定參照張憲政等[7]的方法。SOD活性以每min每g鮮質(zhì)量樣品抑制氮藍四唑(NBT)光化還原的50%為1個酶活性單位(U)。CAT活性以每min每g樣品催化消耗每mg H2O2為1個活性單位(U)。POD活性以連續(xù)5 min內(nèi)每min每g鮮質(zhì)量樣品的吸光度值增加1為1個活性單位(U)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2003對實驗數(shù)據(jù)進行整理，使用SPSS 16.0軟件包中t-test法對K305ms與K305F相應的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米K305ms雄花的可溶性蛋白含量

可溶性蛋白對于花藥的發(fā)育至關(guān)重要。由圖1可知，在花藥發(fā)育過程中，K305ms和K305F花藥和穎殼可溶性蛋白含量的變化趨勢一致，均先增加后降低，但K305ms花藥和穎殼可溶性蛋白含量均低于相應時期的K305F?；ㄋ幪幱谒姆煮w時期時，K305ms和K305F花藥可溶性蛋白含量均為最高，達到頂峰，而K305ms和K305F穎殼可溶性蛋白含量頂峰時期則在小孢子時期。除小孢子時期外，其余3個時期K305ms花藥可溶性蛋白質(zhì)含量均極顯著低于K305F；K305ms穎殼中可溶性蛋白質(zhì)含量除成熟期以外，其余時期均顯著低于K305F。

2.2 玉米K305ms雄花的游離脯氨酸含量

游離脯氨酸不僅是重要的滲透代謝物質(zhì)，還是花粉萌發(fā)和花粉管生長所必需的能源物質(zhì)。由圖2可知，隨著花藥的發(fā)育，K305ms花藥和穎殼游離脯氨酸含量的變化均呈逐漸降低的趨勢，在成熟期降到最低值；而K305F花藥和穎殼游離脯氨酸含量卻呈現(xiàn)出相反的趨勢，即隨著花藥的生長逐漸升高，在成熟期達到最高值。除此以外，從花藥花粉母細胞期到成熟期的4個階段，K305ms花藥和穎殼的游離脯氨酸含量均明顯低于相應時期的K305F。其中，K305ms花藥中游離脯氨酸含量在4個時期均極顯著低于K305F，其成熟期的游離脯氨酸含量僅為K305F的1.5%；相應地，除花粉母細胞時期外，其余3個時期K305ms穎殼游離脯氨酸含量均顯著或極顯著低于K305F，在成熟期時，K305ms穎殼脯氨酸含量僅為K305F的8.8%。

數(shù)值代表3次重復的平均值±SE；星號代表使用t-test方法統(tǒng)計在0.05(*)和0.01(**)水平下K305ms和K305F之間差異達到顯著水平。Ⅰ，花粉母細胞時期；Ⅱ，四分體時期；Ⅲ，小孢子時期；Ⅳ，成熟期。下同。Values are the means of 3 samples ±SE. Asterisks indicate statistically significant difference at 0.05 (*) and 0.01 (**) levels between K305ms and K305F using t-test. Ⅰ， Pollen mother cell stage; Ⅱ， Tetrad stage; Ⅲ， Microspore stage; Ⅳ， maturity. The same as below.圖1 花藥發(fā)育過程中K305ms和K305F植株花藥(A)與穎殼(B)中可溶性蛋白含量Fig.1 Soluble protein content in anther (A) and glume(B) of K305ms and K305F plants during anther development

圖2 花藥發(fā)育過程中K305ms和K305F植株花藥(A)與穎殼(B)中游離脯氨酸含量Fig.2 Free proline content in anther (A) and glume (B) of K305ms and K305F plants during anther development

2.3 玉米K305ms雄花的抗氧化酶活性

2.3.1 SOD活性

2.3.2 CAT活性

植物CAT是一種重要的保護性酶，可將H2O2降解成水和氧氣，清除其對細胞的毒害。由圖4可知，在花藥發(fā)育過程中，K305ms花藥的CAT活性均顯著或極顯著低于K305F，且呈現(xiàn)逐漸下降趨勢。但是在花藥發(fā)育前期，K305ms穎殼的CAT活性高于K305F，且在花粉母細胞時期顯著高于K305F；隨著花粉發(fā)育至中后期，K305ms穎殼的CAT活性低于K305F，但未達到顯著差異。

圖3 花藥發(fā)育過程中K305ms和K305F植株花藥(A)與穎殼(B)中SOD活性Fig.3 Superoxide dismutase (SOD) activity in anther (A) and glume (B) of K305ms and K305F plants during anther development

圖4 花藥發(fā)育過程中K305ms和K305F植株花藥(A)與穎殼(B)中CAT活性Fig.4 Catalase (CAT) activity in anther (A) and glume (B) of K305ms and K305F plants during anther development

2.3.3 POD活性

植物POD可有效清除H2O2對細胞的毒害，還具有氧化分解花藥中植物生長素IAA的作用。從圖5可知，花藥發(fā)育過程中，K305ms花藥POD活性均顯著或極顯著高于K305F；且其POD活性表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，而K305F花藥POD活性則相反，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；成熟期K305ms花藥POD活性達到最高，為K305F的28.6倍。K305ms穎殼的POD活性也均明顯高于K305F，且在花藥發(fā)育前2個時期，差異達到極顯著水平。

圖5 花藥發(fā)育過程中K305ms和K305F植株花藥(A)與穎殼(B)中POD活性Fig.5 Peroxidase (POD) activity in anther (A) and glume (B) of K305ms and K305F plants at anther developmental stage

3 討論

3.1 玉米細胞核雄性不育的代謝物質(zhì)基礎(chǔ)

可溶性蛋白質(zhì)在花藥發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，其含有眾多的代謝酶和活性成分，參與花藥的代謝和發(fā)育過程。前人研究表明，任何干擾蛋白質(zhì)合成、代謝、分解的基因發(fā)生突變，都有可能導致雄性不育現(xiàn)象發(fā)生[8]?；ㄋ幇l(fā)育過程中，不育株花藥中可溶性蛋白質(zhì)含量明顯低于可育株，在花粉母細胞時期、四分體和成熟期這3個時期均達到極顯著差異。不僅如此，不育株穎殼中的可溶性蛋白質(zhì)含量也明顯低于可育株，其中3個時期達到顯著差異。說明60Co-γ輻射引起的目標基因突變，導致了玉米雄花發(fā)育過程中蛋白質(zhì)合成和代謝出現(xiàn)明顯異常。

植物生殖生長期，花粉中會積累大量的游離脯氨酸，一些作物中游離脯氨酸含量高達花粉干質(zhì)量的1.6%[9]。游離脯氨酸是花粉代謝活動中一個非?；钴S的化合物，可提供花粉萌發(fā)和花粉管伸長所必需的能量、碳骨架[10-11]。Chiang等[12]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥小花中游離脯氨酸含量占總游離氨基酸含量的17%～26%，葉片與根中卻僅占1%～3%。Schwacke等[13]發(fā)現(xiàn)番茄花的游離脯氨酸含量是其他組織的60倍。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著花藥的發(fā)育，可育花藥中游離脯氨酸含量呈現(xiàn)急劇增加的趨勢，說明游離脯氨酸的積累與生殖生長密切相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果一致[12-14]。鄒佳等[8]發(fā)現(xiàn)玉米細胞質(zhì)雄性不育小花中脯氨酸含量顯著低于其恢復系。除此以外，在甜椒[15]、胡蘿卜[16]、辣椒[17]、小麥[18]、番茄[19]中均發(fā)現(xiàn)雄性不育花藥內(nèi)游離脯氨酸含量低于可育株。本研究發(fā)現(xiàn)，不育花藥中游離脯氨酸含量從花粉母細胞時期到成熟時期均極顯著低于可育株，尤其是在成熟期，其游離脯氨酸含量僅為可育株的1.5%；同樣，不育株穎殼中游離脯氨酸含量在花粉發(fā)育過程中也顯著低于可育株，在成熟期其游離脯氨酸含量僅為可育株的8.8%。說明玉米生殖生長過程中，不育株目標基因突變導致雄花游離脯氨酸無法正常積累，脯氨酸代謝出現(xiàn)紊亂。植物生殖生長期間，特別是花粉發(fā)育和胚胎形成期，生殖細胞會經(jīng)歷一個自發(fā)的脫水過程，脫水可造成對細胞的滲透脅迫[20]。但植物體內(nèi)的脯氨酸，作為一種重要的滲透相容性物質(zhì)，其大量積累有助于生殖器官的滲透調(diào)節(jié)[11, 21]。本研究發(fā)現(xiàn)不育花藥游離脯氨酸在花藥發(fā)育過程中不僅沒有逐漸積累，反而逐漸降解，這種趨勢同樣存在于不育株穎殼中?；ㄋ幇l(fā)育過程中游離脯氨酸的含量僅維持在0.11～0.14 mg·g-1，遠低于可育花藥中的游離脯氨酸含量。說明玉米生殖生長過程中，不育植株目標基因突變導致花藥中游離脯氨酸含量降低，花藥遭受滲透脅迫危害。

3.2 玉米細胞核雄性不育與抗氧化酶活性代謝的關(guān)系

植物活性氧清除酶系統(tǒng)(ROS)，如SOD[22]、POD[23]和CAT[24]等可有效阻止高濃度氧的積累，防止膜脂的過氧化，維持植物的正常生長發(fā)育[23, 25]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)這些酶的活性與植物雄性不育現(xiàn)象相關(guān)。有研究認為不育株ROS系統(tǒng)活性會降低，導致植株體內(nèi)活性氧水平升高，進而造成膜脂過氧化[26]；不過，在對榨菜、花椰菜和王百合等植物的研究中發(fā)現(xiàn)，不育株ROS系統(tǒng)活性明顯高于可育株，其體內(nèi)活性氧含量超量積累，認為ROS系統(tǒng)活性的升高正是對自身活性氧升高的一種保護應激反應[27-29]。

張子學等[30]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒不育系花藥的SOD活性與可育系差異不顯著；而張建奎等[31]研究發(fā)現(xiàn)，小麥不育系花藥中SOD活性卻明顯低于可育系。本研究結(jié)果顯示，花藥發(fā)育過程中，玉米不育花藥中SOD活性明顯低于可育株，且在花粉母細胞期、四分體期和成熟期達到顯著或極顯著差異，說明不育植株目標基因突變導致植株花藥中滲透調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常。不過，K305ms不育花藥POD活性與CAT活性的變化趨勢相反。不育花藥POD活性隨著發(fā)育進程呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在花藥成熟期達到可育株的28.6倍；而不育花藥CAT活性隨著花藥發(fā)育呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，在花藥成熟期僅為可育株的8.2%。這一趨勢與小麥雄性不育系花藥POD和CAT活性變化趨勢一致[32]。前人研究發(fā)現(xiàn)，不育花藥CAT酶活性過低則不能有效地清除超氧自由基，導致H2O2大量積累，進而造成膜脂過氧化，花粉敗育[26]。因此，推測不育株中目標基因突變導致的植株花藥中CAT活性降低，可能造成超氧自由基過量積累，進而損害花藥的正常發(fā)育。植物中POD對于花藥的發(fā)育具有至關(guān)重要的作用[33]。POD作為保護性酶，不僅能清除H2O2對細胞的毒害，還可分解花藥中的生長激素IAA。研究表明，植物生殖生長期，花蕾中POD活性與體內(nèi)IAA含量呈負相關(guān)，即POD活性升高會導致IAA含量降低，最終造成花粉敗育[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米花藥發(fā)育過程中，不育花藥的POD活性明顯高于可育株，隨著花藥發(fā)育進程呈急劇升高的趨勢。因此，認為不育植株目標基因突變導致POD活性提高，可能會加速對花藥中IAA的分解，造成花藥中IAA不足，從而影響其正常發(fā)育。