史妍君,鐘 建，黃占斌*，馬 筠，張世偉*，柯 超

[1.中國礦業(yè)大學(北京)化學與環(huán)境工程學院，北京 100083；2.中國科學院微生物研究所，北京 100101]

目前，我國已成為世界上最大的化肥生產(chǎn)國和消費國，但是由于不合理施肥導致化肥的利用效率很低，如農(nóng)田的氮肥利用率一般為30%～40%，而磷肥的當季利用率僅有10%～20%[1]，長期施用化肥不僅影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，造成土壤微生物多樣性失調(diào)，還會通過各種途徑造成嚴重的環(huán)境污染[2-3]。微生物多樣性是表征土壤質(zhì)量變化的重要指標之一，微生物種群功能對土壤管理具有重要的指導作用，而施肥可顯著改變土壤微生物種群特性[4-5]，影響土壤微生物數(shù)量、種群結(jié)構(gòu)，另外,長期施入化肥還會降低土壤的微生物活性[6]。因此，有學者[7]指出有效合理地施肥、提高肥料效率，研制高效、專用的肥料是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學領(lǐng)域亟需解決的熱點問題。

高分子保水材料(Super Absorbent Polymer，SAP)是具有吸水和保水能力的一類高分子聚合物，一般可吸收自身400～600倍甚至更高倍數(shù)的純水，其所吸收水分緩慢釋放后可供植物利用[8]。SAP施用于土壤能改善植物根際土壤結(jié)構(gòu)而促進土壤保水保肥，提高肥料利用效率。田間試驗發(fā)現(xiàn)，SAP與尿素氮肥配合使用，吸氮量和氮肥利用率分別提高18.7%和27.1%[9]。筆者所在課題組前期采用納米碳、腐植酸保水劑為添加劑，研發(fā)出納米碳增效劑(CSH：納米碳Carbon nano，高分子保水劑Super absorbent polymer，腐植酸Humic acid)[10]。

柑橘是我國南方地區(qū)種植面積最大的水果，該地區(qū)土壤類型主要為山地黃壤，土壤肥力水平通常較低，且缺乏多種養(yǎng)分，導致柑橘生產(chǎn)過程中存在著產(chǎn)量較低與品質(zhì)不佳的問題[11]。本研究采用田間試驗探討了納米碳增效劑對柑橘產(chǎn)量及根際微生物數(shù)量、微生物多樣性的影響，以期為提高柑橘產(chǎn)量，減少化肥施用量，合理科學的施肥管理提供科學依據(jù)，并為納米碳增效劑在生態(tài)農(nóng)業(yè)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

試驗樣地選在我國長江三峽庫區(qū)重慶市萬州區(qū)龍沙鎮(zhèn)龍安村的柑橘示范田，屬亞熱帶季風濕潤帶，四季分明，光照充足，雨量充沛，無霜期長。年平均氣溫17.7 ℃，其中1月平均氣溫6.7 ℃，7月平均氣溫28.5 ℃，年降水量1 243 mm，年均日照時數(shù)924 h，主要土壤類型為山地黃壤，處理前田間測定土壤pH值5.07～5.63。

圖1 取樣地點

1.2 試驗設(shè)計與取樣

為研究納米碳增效劑對土壤微生物種群影響，結(jié)合當?shù)厥┓柿晳T以及施肥強度，在柑橘試驗樣地中設(shè)置施肥的正交試驗，以納米碳、腐植酸保水劑和專用復(fù)合肥3因素3水平正交試驗設(shè)計9個小區(qū)，分別為ZJ2、ZJ3、ZJ4、ZJ5、ZJ6、ZJ7、ZJ8、ZJ9、ZJ10，其中每個小區(qū)施用納米碳10～30 g、腐植酸保水劑1.2～2.4 kg、專用復(fù)合肥16～12 kg遞減，具體見表1，同時設(shè)置對照區(qū)ZJ1(當?shù)爻Ｒ?guī)專用復(fù)合肥100%用量)，共10個處理，各處理均設(shè)6棵柑橘樹，每棵果樹占地面積3 m×3 m，之間有溝渠隔離。土壤第一次取樣時間為2016年3月21日，取樣后施肥，施肥時間為3月25日，第一次取樣后將取樣點做好標記，以便第二次取同一地點土壤，土壤第二次取樣時間為7月21日，柑橘果實取樣時間為2017年1月19日。其中土壤第一次取樣樣本用于測定基本理化性質(zhì)，第二次取樣樣本用于細菌種群多樣性分析。

表1 正交試驗因素水平表

注：A1、A2、A3的用量分別是10、20、30 g/小區(qū)；B1、B2、B3的用量分別是1.2、1.8、2.4 kg/小區(qū)；C1、C2、C3的用量分別是16、14、12 kg/小區(qū)。

土壤取樣方法：隨機在距離柑橘樹根外圍近根處，取土壤表層(0～10 cm)土樣[12]，每個小區(qū)選取3棵大小基本一致的柑橘樹，按照五點取樣法，采集每棵果樹的5個樣點并混合均勻(約50 g)，將每次取的土壤樣品用自封袋裝好后分別編號并置于4 ℃保鮮箱保存，快速運回實驗室后取出凍干，過0.1 mm篩后，備用[12-13]。

柑橘樣品的取樣方法：將取土樣對應(yīng)的3棵柑橘樹上無機械損傷及病蟲害的健康果實全部采摘，自封袋分別編號后保鮮箱保存，快速運回實驗室，測定單棵樹柑橘產(chǎn)量均值，單棵樹產(chǎn)量均值與單棵樹上柑橘個數(shù)之比為柑橘單果重。

1.3 土壤的基本理化性質(zhì)及測定方法

土壤pH值用電位法測定，有機質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測定，堿解氮采用堿解容量法測定，有效磷用鉬銻抗比色法測定。表2為施肥后柑橘收獲時期土壤理化性質(zhì)。

表2 柑橘田土壤的基本理化性質(zhì)

1.4 測序和數(shù)據(jù)分析

實驗采用細菌16S rRNA基因的V4-V5區(qū)通用引物GTGCCAGCMGCCGCGGTAA與GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應(yīng)體系如下：10 μmol/L的正反向引物各1 μL，dNTPs(2.5 μmol/L)2 μL，10×PyrobestBuffer 2.5 μL，PyrobestDNA Polymerase(2.5 U/μL)0.15 μL，DNA模板2 μL，用ddH2O補平至25 μL體系。PCR產(chǎn)物混勻后用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，再用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)切膠回收。將回收的PCR產(chǎn)物用Qubit進行定量化和均一化，用Illumina建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，并用Agilent 2100(Agilent，USA)檢測文庫片段分布，將構(gòu)建好的合格文庫上機送至諾和致源的PE250 Hiseq 2500測序平臺測序分析。

將原始數(shù)據(jù)進行去雜、拼接、過濾以及去除嵌合體等，得到有效序列(Effective tags)，利用Uparse軟件(Uparse v 7.0)對Effective Tags進行聚類，按照97%的相似性劃分OTUs(Operatinal Taxonomic Units)，同時選取OTUs出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs的代表序列，并基于軟件Mothur(version 1.36.1)對OTUs的代表序列于SILVA數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)進行物種注釋，獲得在不同分類水平上各個樣本的種群組成。使用PyNAST軟件(Version 1.2)與Green Gene數(shù)據(jù)庫獲得所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的作為標準進行均一化處理。使用Mothur計算常用的生物多樣性指數(shù)：Shannon值越大說明物種的多樣性越大；Simpson值越大，說明物種的均勻度越大；Chao1與ACE值越高說明種群物種的豐富度越高。

使用R軟件(version 2.15.3)繪制物種豐度聚類熱圖。

方差分析采用SPSS 21.0對組間數(shù)據(jù)進行One-way ANNOVA LSD檢驗，P<0.05作為差異顯著性標準，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010，繪圖采用Origin 9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗確定柑橘產(chǎn)量的最優(yōu)組合

由極差值R與方差分析可見(表3、表4)，影響柑橘產(chǎn)量因素的主次順序為C>A>B，且每一個因素均對柑橘產(chǎn)量的影響差異顯著(P<0.05)。由此，試驗結(jié)果確定柑橘產(chǎn)量的最佳施肥組合為A2B1C2(ZJ5)，在此最優(yōu)組合下的產(chǎn)量為4.68 kg，而對照ZJ1的產(chǎn)量僅為4.43 kg，柑橘產(chǎn)量比對照提高了5.64%。

表3 正交設(shè)計及柑橘產(chǎn)量結(jié)果

表4 正交試驗結(jié)果的方差分析

2.2 物種稀釋曲線

由圖2可知，當觀察到的OTUs達到2 000個左右時，曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)較為合理，更多的數(shù)據(jù)只會產(chǎn)生少量新的物種，并不影響整體物種組成。

2.3 土壤細菌的a多樣性分析

基于HiSeq 2500測序平臺分析不同施肥處理的土樣，去除嵌合體后，最終可用于后續(xù)分析的Effective Tags序列共637 282條。由表5可以看出，物種覆蓋度的最小值達到了0.980，說明測序深度合理，覆蓋到了絕大多數(shù)的類群，可以進行后續(xù)分析。

圖2 稀釋曲線

由圖3可以看出，物種豐富度指數(shù)(Chao1，ACE)ZJ6最大，ZJ5最小，表明ZJ6物種種類最多，ZJ5物種種類最少；ZJ2、ZJ4與空白條件下香濃指數(shù)較接近，且均較低，表明ZJ2、ZJ4與空白物種種類較少；ZJ5、ZJ9的香濃指數(shù)均較低，表明多樣性降低。由ZJ1-ZJ2多樣性指數(shù)變化趨勢分析得知，在納米碳用量保持不變情況下，隨著保水劑用量增加，復(fù)合肥用量降低，微生物多樣性升高，但是升高幅度較小，說明微生物多樣性受保水劑影響較?。挥蒢J4-ZJ5多樣性指數(shù)變化趨勢分析得知，在納米碳用量增加一倍后，隨著保水劑增加，復(fù)合肥用量降低，微生物多樣性明顯降低，表明微生物多樣性受復(fù)合肥影響較大；同時由ZJ5-ZJ6多樣性指數(shù)變化趨勢分析得知，在納米碳用量不變情況下，隨著保水劑與專用復(fù)合肥用量增加，微生物多樣性升高幅度較大，結(jié)合ZJ4-ZJ5多樣性指數(shù)變化趨勢可知，微生物多樣性受專用復(fù)合肥影響大于納米碳，由ZJ6-ZJ7多樣性指數(shù)變化趨勢分析得出，在納米碳用量增加，保水劑用量減少，專用復(fù)合肥用量減少情況下，微生物多樣性降低，且降低幅度小于ZJ5-ZJ6多樣性指數(shù)的增加幅度。由此說明，微生物多樣性受復(fù)合肥影響最大，納米碳次之，腐植酸保水劑最小。

表5 正交試驗組合柑橘土壤微生物種群的a多樣性分析

圖3 不同處理多樣性指數(shù)趨勢圖

2.4 物種相對豐度比較

由圖4可知，10個土壤細菌在門水平上豐度差異較大。按照種群相對豐度從高到低排序，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinbacteria)、醋酸菌門(Acidobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。其中變形菌門(Proteobacteria)豐度最高的是ZJ2(57.67%)，相對于最低的ZJ8(36.52%)提高了21.15%，相對于空白(ZJ1，43.59%)提高了14.08%。放線菌門(Actinbacteria)豐度最高的是ZJ5(22.49%)，相對于最低的ZJ2(13.83%)提高了8.56%，相對于對照(ZJ1，20.2%)提高了2.29%。疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度最高的是ZJ4(9.31%)，相對于最低的ZJ5(1.45%)提高約7.86%，相對于對照(ZJ1，3.75%)提高約4.11%。由此可見，在最優(yōu)組合ZJ5條件下放線菌門(Actinbacteria)豐度最高，疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度最低。

圖4 門水平上的物種相對豐度

2.5 土壤細菌種群與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

為了更直觀地展現(xiàn)不同施肥處理土壤細菌種群的多樣性，根據(jù)所有樣品在屬水平上的物種注釋及豐度信息，選取相對豐度排名前35的屬，根據(jù)每個樣本中的豐度信息，從種屬和樣品兩方面同時聚類，生成熱圖，見圖5。在豐度排名前35的屬中，ZJ1(對照)中土壤細菌較高的屬為Gaiella、Candidatus_Nitrosotalea，ZJ2中相對豐度最高的3個屬為Phenylobacterium、Ohtaekwangia、多嗜菌(Variovorax)，ZJ3中相對豐度最高的3個屬為乳酸菌(Lactobacillus)、Massilia、Sphingomonas，ZJ4中相對豐度最高的3個屬為Canddatus_Koribacter、Telmatobacter、Candidatus_Solibacter，ZJ6中最高的2個屬為Chthonibacter、浮游菌屬(Planctomyces)，ZJ7中最高的2個屬為Nakamurella、Mizugakiibacter，ZJ8中最高的屬為Jatrophihabitans、Actinospica。ZJ9中豐度最高的屬為脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)。在柑橘產(chǎn)量最優(yōu)組合(ZJ5)下發(fā)現(xiàn)相對豐度最高的2個屬為根霉屬(Rhizomicrobium)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)。

圖5 柑橘田土樣的細菌物種豐度(前35個屬)聚類熱圖

通過正交組合不同施肥條件的微生物種群特征與理化指標的典范性對應(yīng)分析(CCA)，見圖6，發(fā)現(xiàn)施肥與pH、有機質(zhì)呈顯著正相關(guān)，與堿解氮呈顯著負相關(guān)，即環(huán)境因子對微生物種群的影響大小順序為pH>有機質(zhì)>堿解氮。

圖6 土壤微生物種群與土壤理化性質(zhì)的典型關(guān)聯(lián)分析(CCA)

3 討論與結(jié)論

3.1 不同施肥組合對柑橘產(chǎn)量的影響

據(jù)報道，納米碳在蘿卜、白菜、甘藍、馬鈴薯等蔬菜作物上產(chǎn)生了明顯的增產(chǎn)效果[14]。研究還發(fā)現(xiàn)噴施腐植酸可促進柑橘增產(chǎn)、增收[15-16]。在本實驗中，通過優(yōu)化施用納米碳增效劑比例發(fā)現(xiàn)柑橘產(chǎn)量的最佳施肥組合為A2B1C2，在該組合下的柑橘產(chǎn)量可達到4.68 kg，比最低的組別產(chǎn)量提高了25.8%，顯著提高柑橘產(chǎn)量。由此表明，合理使用納米碳增效劑可顯著提高柑橘產(chǎn)量。

3.2 不同施肥組合對土壤微生物種群多樣性的影響

研究發(fā)現(xiàn)ZJ5中的放線菌門(Actinbacteria)相對于ZJ1提高了2.29%，達到22.49%，研究還發(fā)現(xiàn)ZJ5中的根霉屬(Rhizomicrobium)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)相對豐度分別達到6.04%和9.97%，較最低的1.20%(ZJ1)和7.11%(ZJ1)分別提高了約4.84%和2.86%。胡杰等[17]研究發(fā)現(xiàn)從土壤中根際分離出來的鞘脂單胞菌，跟植物的聯(lián)系非常緊密，可在根際分泌糖類營養(yǎng)物，促進植物吸收，這與Kinura[18]與Donnell[19]的研究結(jié)果相一致。由此表明，不同施肥組合改變了土壤微生物種群多樣性。

3.3 環(huán)境因子的改變對微生物種群多樣性的影響

在研究中發(fā)現(xiàn)柑橘產(chǎn)量提高，其土壤有機質(zhì)含量也提高，但是多樣性指數(shù)較其他組別降低(圖3)。另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)，施用SAP復(fù)合肥后土壤整體pH值升高。土壤pH是影響土壤細菌種群地理分布的主要因子。Enwall[20]發(fā)現(xiàn)pH對細菌種群的改變起主導作用，土壤酸堿性變化會導致微生物多樣性無法適應(yīng)而數(shù)量降低。Meng等[21]研究發(fā)現(xiàn)長期施用氮肥會導致土壤中的酸緩沖能力下降，造成土壤酸化，張曉玲[22]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生土壤酸化的主要原因是氮的輸入，因為在氮循環(huán)過程中產(chǎn)生大量的氫離子，這些氫離子與肥料及土壤中的酸根離子結(jié)合，形成硫酸、鹽酸等強酸，進而導致土壤酸化，土壤酸化影響了土壤微生物的生存，使其處于脅迫狀態(tài)，抑制土壤細菌和放線菌的繁殖與生長，例如可導致嗜酸性細菌在細菌種群中的比重增大等[23-25]。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)，氮肥與有機肥配施能降低氮循環(huán)效應(yīng)而緩解氮肥導致的土壤酸化現(xiàn)象，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)組合下的有機質(zhì)含量最高，推測可能是有機質(zhì)中堿性物質(zhì)的輸入避免了土壤中堿性物質(zhì)的過度消耗，從而緩解酸化程度，還有可能是有機質(zhì)釋放堿性物質(zhì)，消耗氫離子導致土壤pH值升高。由此表明，專用復(fù)合肥與納米碳保水劑配合施用能在一定程度上緩解氮肥導致的土壤酸化現(xiàn)象。

3.4 土壤養(yǎng)分對微生物種群多樣性的影響

在本研究中，納米碳增效劑與專用復(fù)合肥對微生物種群多樣性影響較大，施用專用復(fù)合肥引起土壤種群生物量明顯增加，土壤中的氮素被微生物吸收利用后，在體內(nèi)合成具有重要生理作用的蛋白質(zhì)、核酸等大分子，因此土壤中氮素缺乏將會嚴重限制土壤微生物的活性。魯劍巍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，施入氮肥對柑橘苗的生長情況影響較大，合理施用氮肥可提高柑橘產(chǎn)量與品質(zhì)。本研究中發(fā)現(xiàn)，在納米碳、腐植酸保水劑最優(yōu)組合下疣微菌門(Verrucomicrobia)減少，放線菌門(Actinbacteria)增加。疣微菌門(Verrucomicrobia)廣泛分布于根際和團聚體土壤中，其豐度與多種碳水化合物代謝相關(guān)的基因有關(guān)，可能在碳生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，同時地理格局也是其豐度改變的主要驅(qū)動因子。因此，疣微菌門(Verrucomicrobia)的豐度差異可能與地理因素引起的生態(tài)多樣性和土壤營養(yǎng)情況不同有關(guān)。土壤中的放線菌可轉(zhuǎn)化土壤中的有機質(zhì)，同時還可對植物土傳病原菌起到一定的拮抗作用，促進根區(qū)土壤微生物的健康發(fā)展[27]，但SAP復(fù)合肥是如何通過影響微生物種群調(diào)節(jié)柑橘產(chǎn)量與品質(zhì)的還需要進一步的探究。