陸冰 劉洲 林智君 陳煜森 陳秋萍

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中心， 廣東 湛江524001)

目前亞洲高齡人群中血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)的發(fā)病率高于老年性癡呆(Alzheimer's disease, AD)居第一位[1]，成為老年患者癡呆的首發(fā)原因[2]。研究表明，血管內(nèi)皮損傷所引起的腦缺血性損害是VaD形成的重要因素之一[3-4]；因此，血管內(nèi)皮功能在VaD發(fā)病機(jī)制中的作用開始引起學(xué)者關(guān)注。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelium progenitor cells, EPCs)是一種來源于骨髓的前體細(xì)胞，具有修復(fù)血管內(nèi)皮的能力，EPCs不足以代償血管內(nèi)皮損傷及修復(fù)之間的失衡可致血管內(nèi)皮功能失調(diào)[5]。本研究通過觀察VaD患者與同齡認(rèn)知功能正常人群外周血EPCs數(shù)目的差異及比較血管內(nèi)皮功能指標(biāo)：血清血管緊張素(AngⅡ)及血管緊張素1-7(Ang1-7)的水平，為VaD的臨床防治提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 一般資料 選取2015年～2017年于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的患者100例。采用國際神經(jīng)科學(xué)研究會診斷標(biāo)準(zhǔn)和國內(nèi)學(xué)者對VaD的診斷共識，將受試者分為兩組：VaD組(55例)，認(rèn)知正常組(45例)?；颊咦栽概浜?，取得醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。VaD組納入標(biāo)準(zhǔn)：①有明確腦血管病史(經(jīng)過核磁影像檢查和診斷確認(rèn))，發(fā)病3個(gè)月后逐漸出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，此前無認(rèn)知障礙史；②Hachinski缺血指數(shù)大于7分；③目前腦血管病穩(wěn)定，3個(gè)月內(nèi)無新發(fā)卒中事件(頭顱CT/MRI證實(shí))。受試者排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前3個(gè)月內(nèi)新發(fā)腦卒中、外傷、顱腦手術(shù)；②腦血管病以外的因素所致的認(rèn)知功能障礙；③意識障礙、嚴(yán)重的視聽力障礙、失語及不能配合進(jìn)行神經(jīng)心理測試的患者；④患有嚴(yán)重器質(zhì)性疾??；⑤服用其它可能影響認(rèn)知功能的藥物；⑥目前服用影響EPCs水平的藥物(如他汀類、膽堿酯酶抑制劑等)

1.2 臨床資料 詳細(xì)獲取患者病史、年齡、文化程度、體重指數(shù)(BMI)、血壓、血脂、空腹血糖、頸動脈內(nèi)膜厚度(IMT)等基本信息。采用全自動生化分析儀測定生化指標(biāo)；采用頸動脈彩色多普勒超聲測定受試者雙側(cè)IMT，取平均值進(jìn)行分析。

1.3 認(rèn)知功能評定 應(yīng)用簡易智能精神量表(MMSE)評定所有受試者的認(rèn)知功能，MMSE最高得分為30分。認(rèn)知障礙的判斷根據(jù)文化程度分為：文盲≤17分，初中<21分，高中<22分，大學(xué)≤23分。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測外周血EPCs水平 受試者清晨空腹2ml靜脈血，置于EDTA管抗凝分離單個(gè)核細(xì)胞，加入膜抗體CD34+、CD133+單克隆抗體，以同型抗體作為對照，室溫避光放置5min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀設(shè)定單個(gè)核細(xì)胞門來檢測外周血EPCs水平。

1.5 ELIAS檢測血清AngⅡ、Ang1-7水平 靜脈血離心后取血漿，采用ELISA試劑盒檢查，酶標(biāo)儀在波長450mm處測定各樣本的吸光度值，檢測血清中AngⅡ及Ang1-7的水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組受試者的年齡、性別、文化程度、BMI、血壓、血脂、空腹血糖、IMT比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。VaD組MMSE評分低于認(rèn)知正常組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床基線資料的比較Table 1 Comparison of baseline clinical data between the two groups

注：與認(rèn)知正常組比較，①P<0.05；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白；TG：甘油三指；HDL-C：高密度脂蛋白；FPG：空腹血糖

2.2 兩組外周血EPCs水平及血管緊張素水平的比較 通過流式細(xì)胞儀標(biāo)記，根據(jù)表面標(biāo)記為CD34+/CD133+的細(xì)胞來確認(rèn)EPCs數(shù)目(圖1)。VaD組外周血EPCs數(shù)目明顯低于認(rèn)知正常組(P<0.05)；VaD患者血清AngⅡ水平較認(rèn)知正常組增加，Ang1-7水平較認(rèn)知正常組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

圖1 流式細(xì)胞儀標(biāo)定測定外周循環(huán)EPCs水平

Figure1CirculatingEPCscontentsweredeterminedbyflowcytometry

注：A.綠色畫圈對淋巴細(xì)胞群設(shè)窗；B.Q2區(qū)域代表CD133+/CD34+雙陽性細(xì)胞

Table2ComparisonofEPCsnumbersandangiotensinlevelsbetweenthetwogroups

注：與認(rèn)知正常組比較，①P<0.05

2.3 VaD組外周血EPCs數(shù)目與血管緊張素水平的相關(guān)性分析 VaD組外周血EPCs數(shù)目與血清AngⅡ含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.44，P<0.05)；與血清Ang1-7含量呈正相關(guān)(r=0.51，P<0.05)。

2.4 VaD組MMSE評分與外周血EPCs數(shù)目、血管緊張素水平的相關(guān)性分析 VaD組MMSE評分與外周血EPCs數(shù)目呈正相關(guān)(r=0.679，P=0.000)。排除年齡、性別、體重指數(shù)、血壓、血糖、血脂、IMT的影響后，此關(guān)系仍存在(r=0.545，P=0.000)；VaD組MMSE評分與血清Ang1-7水平呈正相關(guān)(r=0.461，P=0.007)；與血清AngⅡ水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.359，P=0.004)，見表3。

表3VaD組MMSE評分與循環(huán)EPCs數(shù)目及血管緊張素水平的相關(guān)性分析

Table3CorrelationanalysisbetweenMMSEscoreandthenumbersofcirculatingEPCs,angiotensinlevelsinVaDgroup

變量rPEPCs0.5450.000Ang1-70.4610.007 AngII-0.3590.004

3 討論

近年來，VaD發(fā)病機(jī)制的研究僅集中在神經(jīng)元方面，對缺血區(qū)域腦灌注及血管內(nèi)皮的關(guān)注甚少。低灌注狀態(tài)下的腦細(xì)胞氧代謝受到抑制，繼而使主導(dǎo)認(rèn)知的腦組織內(nèi)部環(huán)路傳遞中斷是VaD重要的病理機(jī)制[6]。如何有效修復(fù)血管內(nèi)皮為缺血區(qū)域提供良好的微循環(huán)是VaD認(rèn)知功能得以改善的基礎(chǔ)及關(guān)鍵。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在組織缺血的刺激下，骨髓源性EPCs被大量動員歸巢至缺血區(qū)域，通過修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮[7]及血管新生[8]，建立側(cè)支循環(huán)，以改善缺血局部血流灌注[9]。缺血是EPCs動員的一個(gè)明確的刺激因素，EPCs作為一種血管保護(hù)機(jī)制為缺血區(qū)域的血供提高有利環(huán)境[10]。動員外周血EPCs是改善VaD缺血損傷區(qū)域血流灌注及修復(fù)神經(jīng)功能的重要環(huán)節(jié)，對主導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶的海馬區(qū)域的意義重大。目前已有研究表明，EPCs-血管新生機(jī)制在改善大鼠局灶性缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙中發(fā)揮積極作用[11]。本研究顯示，VaD患者外周血EPCs數(shù)目較認(rèn)知正常組明顯減少，且與MMSE評分呈正相關(guān)。推測外周血EPCs參與腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生及進(jìn)展，外周血EPCs的減少可能在VaD發(fā)病及發(fā)展中起著重要的作用。

目前已證實(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)廣泛分布于與認(rèn)知功能密切聯(lián)系的區(qū)域，參與調(diào)節(jié)與認(rèn)知相關(guān)的復(fù)雜功能，如感覺信息、學(xué)習(xí)記憶等。因此，RAS成為目前研究卒中后癡呆的候選因素之一。中樞AngⅡ可以抑制皮質(zhì)中乙酰膽堿的釋放，影響腦高級神經(jīng)功能[12]。AngⅡ的受體AT1R不僅存在于腦組織，還分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞[13]，參與體內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激[14-15]。腦缺血病理狀態(tài)下，腦細(xì)胞氧化-還原穩(wěn)態(tài)失衡所引起的氧化應(yīng)激是循環(huán)及腦內(nèi)的RAS過度激活的重要機(jī)制[16]，可引起AngⅡ顯著增加；AngⅡ作為RAS的重要效應(yīng)因子，是RAS直接作用于血管床使血管收縮的血管活性肽。此外，高水平AngⅡ還可以通過抗衡凋亡調(diào)控因子Bcl-2的活性，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙。因此，有必要探討卒中后癡呆與血清中AngⅡ水平的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，VaD患者血清AngⅡ水平較認(rèn)知正常組顯著增高，且與MMSE評分呈負(fù)相關(guān)?？梢?，血清AngⅡ參與了卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生，其表達(dá)水平與VaD的病情發(fā)展密切相關(guān)。AngⅡ通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)及血管活性物質(zhì)的表達(dá)[17]，促進(jìn)EPCs的衰老及減少EPCs向外周遷移，降低外周血中EPCs的數(shù)目，從而削弱EPCs的內(nèi)皮修復(fù)能力[18]。本研究顯示，VaD患者循環(huán)血EPCs數(shù)目與血清AngⅡ水平呈負(fù)相關(guān)?？梢姡錋ngⅡ水平可直接影響著EPCs向外周血的動員。然而，腦缺血后機(jī)體內(nèi)AngⅡ?qū)PCs動員的影響及對認(rèn)知功能的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

ACE2-Ang1-7-mas是RAS系統(tǒng)另一個(gè)重要分支，Ang1-7是AngⅡ生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性據(jù)抗因子。Ang1-7既可抗衡AngⅡ介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載而擴(kuò)張血管，也可以直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)NO的釋放，通過NO內(nèi)皮依賴機(jī)制產(chǎn)生舒血管作用改善腦血流量[19]。Ang1-7不僅通過增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧后氧化應(yīng)激損傷過程中的抗氧化能力而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護(hù)作用[20]，還可通過釋放的NO介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為促進(jìn)EPCs的動員及血管內(nèi)皮的修復(fù)提高有利的環(huán)境。由此可見，RAS成分主要通過調(diào)節(jié)腦灌注量而影響VaD的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示，VaD的發(fā)病與Ang1-7表達(dá)有關(guān)，低水平Ang1-7的舒血管效應(yīng)受抑制，腦灌注得不到充足改善而引起認(rèn)知功能障礙。本研究顯示，VaD患者血清Ang1-7水平與MMSE評分呈正相關(guān)，提示了血清Ang1-7參與著認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)，其表達(dá)水平與VaD的病情密切相關(guān)。慢性腦缺血的病理狀態(tài)下所引起的氧化應(yīng)激可破壞EPCs正常結(jié)構(gòu)及功能活性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮不可逆性損傷。我們試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VaD患者EPCs數(shù)目與血清Ang1-7表達(dá)水平呈正相關(guān)，推測腦缺血后EPCs動員的調(diào)節(jié)可能與Ang1-7保護(hù)血管內(nèi)皮的作用機(jī)制有關(guān)。后續(xù)工作我們將針對EPCs及RAS對認(rèn)知功能的作用通路進(jìn)一步的設(shè)計(jì)和研究，更好地了解VaD發(fā)病機(jī)制，為VaD的防治提供新思路。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，VaD患者的認(rèn)知功能與外周血EPCs數(shù)目及血清AngII、Ang1-7水平存在一定的相關(guān)性。