楊東升，于 卓，于肖夏，李曉宇，吳國芳，石 悅，張明飛

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

冰草(Agropyron)為禾本科冰草屬多年生草本植物，適應(yīng)性廣、抗旱性和耐寒性強，是牧草及麥類作物雜交改良和遺傳轉(zhuǎn)化的寶貴基因資源，具有重要的飼用價值、生態(tài)價值和經(jīng)濟利用價值[1]。但由于冰草種間差異的原因，會表現(xiàn)出一定的缺點，如蒙古冰草(Agropyronmongolicum)葉量少、莖葉比高，品質(zhì)上有待進一步提升[2]，而航道冰草(Agropyroncristatumcv. Fariway)則可彌補這些不足。四倍體雜交冰草(2n=4x=28)是本課題組以蒙古冰草為母本，航道冰草為父本，通過種間遠緣雜交獲得二倍體雜種F1代，用秋水仙堿溶液進行染色體加倍選育而成的優(yōu)質(zhì)牧草[3-5]，結(jié)合了父本航道冰草分蘗性強、葉量大、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高和母本蒙古冰草抗旱耐寒、耐貧瘠及耐風(fēng)沙等優(yōu)點[6]。

SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記具有通用性強、穩(wěn)定性高、基因組內(nèi)分布范圍廣和標(biāo)記多呈共顯性等優(yōu)點[7-8]，常被用于構(gòu)建植物遺傳連鎖圖譜和分析種質(zhì)資源的遺傳差異性。SRAP(sequence-related amplified polymorphism)標(biāo)記是由Li等[9]提出的一種新型分子標(biāo)記，具有操作簡便、多態(tài)性豐富、價格低廉等優(yōu)點，可有效增加遺傳圖譜的分子標(biāo)記數(shù)。SSR和SRAP標(biāo)記相結(jié)合的技術(shù)在植物遺傳作圖研究中已有一些應(yīng)用，如武耀龍等[10]利用SRAP和SSR標(biāo)記，成功構(gòu)建了一張含有128個標(biāo)記位點的紅麻遺傳連鎖圖譜，圖譜全長為2155.43 cM；朱洪運等[11]用AFLP、SRAP和SSR標(biāo)記構(gòu)建出一張高密度結(jié)球甘藍分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜含有240個標(biāo)記，覆蓋864.4 cM；郭利建等[12]基于SRAP和SSR標(biāo)記，通過區(qū)間作圖法對三原及楊凌兩個環(huán)境下小麥籽粒的淀粉含量、濕面筋含量、粗蛋白質(zhì)含量和Zeleny沉降值進行了QTL定位。

本課題組姜志艷等[13]利用AFLP標(biāo)記首次構(gòu)建了一張含14個連鎖群的四倍體雜交冰草的遺傳圖譜，覆蓋基因組長度2 574.3 cM，標(biāo)記間平均距離3.82 cM。由于AFLP僅為單分子標(biāo)記，圖譜加密有限，且預(yù)擴增時需進行酶切和連接等過程，其操作復(fù)雜且成本高；而SSR與SRAP標(biāo)記相結(jié)合，可使遺傳圖譜上的標(biāo)記分布更為均勻、精度提高[14]。目前關(guān)于SRAP和SSR標(biāo)記在四倍體雜交冰草遺傳作圖上的研究尚未見報道。本研究以四倍體雜交冰草F2代180個分離單株及其親本為作圖材料[13,15]，利用SRAP和SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建其遺傳連鎖圖譜，以期為冰草AFLP、SRAP和SSR三種標(biāo)記整合的高密度遺傳圖譜構(gòu)建，以及產(chǎn)量品質(zhì)、抗旱耐寒等重要性狀的QTL精細(xì)定位、功能基因圖位克隆和分子標(biāo)記輔助育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為四倍體雜交冰草180個F2單株及母本蒙古冰草和父本航道冰草。各材料均種植于呼和浩特市賽罕區(qū)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作場。

1.2 DNA的提取與純度檢測

在分蘗期分別取雜交冰草F2代180個單株及親本的幼嫩葉片，剪碎混勻，各取0.15 g于研缽中加液氮充分研磨，利用植物基因組試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。將符合要求的基因組DNA稀釋至80 ng·μL-1，置于-40 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR和SRAP的引物來源

本試驗所用的108對SSR引物來自NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/)公布的小麥(Tritiumaestivum)、高粱(Sorghumbicolor)及玉米(Zeamays)上已開發(fā)的SSR引物。SRAP引物來源于Li等[9]、Pezzotti等[16]及Lin等[17]已報道的引物，其中正向和反向引物均為12條，將其自由組合得到144對引物，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 反應(yīng)體系及程序

SRAP-PCR體系參考Taq polymerase(紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)說明書，擴增程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性55 s，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩SR-PCR體系與程序參考Taq polymerase(紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司)說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為57 ℃，延伸時間為1 min。參照石 悅等[18]的方法對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

多態(tài)性位點統(tǒng)計：對SRAP及SSR多態(tài)性標(biāo)記位點進行記錄，有條帶的記錄為“1”，無條帶的記錄為“0”，缺失或條帶不清楚的記錄為“-”，生成“0”和“1”組合的原始矩陣。多態(tài)性位點百分率：P=(K/N)×100%，其中K表示多態(tài)性位點數(shù)目、N表示測定位點總數(shù)。

偏分離統(tǒng)計：根據(jù)孟德爾分離規(guī)律，四倍體雜交冰草F2群體的基因型理論上符合3∶1的分離比，在0.05和0.01的水平上，利用卡方檢驗SRAP和SSR標(biāo)記多態(tài)性位點，判斷每一個被檢測到的多態(tài)性位點是否發(fā)生偏分離。

1.6 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

將統(tǒng)計的SRAP和SSR標(biāo)記位點數(shù)據(jù)中的“1”和“0”矩陣轉(zhuǎn)換成軟件要求的目標(biāo)格式，利用作圖軟件Join Map 3.0構(gòu)建四倍體雜交冰草F2分離群體的遺傳連鎖圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP和SSR引物篩選及分子標(biāo)記多態(tài)性分析

以親本及F2群體中的任意3個子代DNA為模板進行適宜引物篩選，在144對SRAP引物自由組合中，共篩選出了10對條帶清晰、多態(tài)性高的引物(圖1，圖2)。這10對SRAP引物組合共擴增出267個位點，其中多態(tài)性位點為240個，平均每對引物產(chǎn)生24個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點百分率為89.9 %(表1)。

用108對SSR引物對親本及F2子代進行檢測，共得到10對SSR多態(tài)性明顯且?guī)颓逦囊锝M合(圖3，圖4)。這些引物組合共產(chǎn)生了277個位點，其中多態(tài)性標(biāo)記位點為235個，平均每對引物組合擴增出23.5個多態(tài)性標(biāo)記位點，多態(tài)性位點百分率為84.8 %(表2)。

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～3：F2單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-3:F2 plants.

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～40：F2單株群體部分單株P(guān)1: Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-40:Partial F2 individuals.

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～3：F2單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-3: F2 plants.

圖3 四倍體雜交冰草部分SSR適宜引物的篩選結(jié)果Fig.3 Screening of suitable SSR primers for tetraploid hybrid crested wheatgrass

P1：航道冰草；P2：蒙古冰草；1～33：F2單株群體部分單株。P1:Agropyron cristatum cv. Fariway; P2:Agropyron mongolicum; 1-33:Partial F2 individuals.

2.2 標(biāo)記偏分離分析

對獲得的共475個標(biāo)記位點進行卡方檢測結(jié)果顯示，在0.05水平上，其中不符合孟德爾分離比的位點有86個，占總標(biāo)記數(shù)的18.11%。四倍體雜交冰草的14個連鎖群均分布有偏分離標(biāo)記，偏分離標(biāo)記數(shù)的范圍為2～11，偏分離標(biāo)記比率的范圍為13.25%～23.81 %，符合植物遺傳作圖的偏分離比率小于30%的要求(表3)。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用軟件Join Map 3.0進行遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。在LOD≥3.0的條件下，構(gòu)建出一張包含475個標(biāo)記(240個SRAP標(biāo)記+235個SSR標(biāo)記)、14個連鎖群的四倍體雜交冰草遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組總長度為1592.7 cM，標(biāo)記間的平均圖距為3.35 cM，各連鎖群長度范圍為67.6～145.2 cM，標(biāo)記數(shù)目在10～83之間，其中標(biāo)記數(shù)目最多且最長的連鎖群為LG2，標(biāo)記數(shù)目最少且最短的連鎖群為LG8(表4，圖5)。

表3 四倍體雜交冰草作圖標(biāo)記的偏分離分析Table 3 Segregation distortion analysis of mapping markers of tetraploid hybrid crested wheatgrass

表4 四倍體雜交冰草遺傳圖譜的基本特征Table 4 Basic characteristic of the genetic linkage map of tetraploid hybrid crested wheatgrass

*表示偏分離標(biāo)記。 * represents distorted marker.

3 討 論

高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜是QTL精細(xì)定位、基因圖位克隆及分子標(biāo)記輔助育種的有效工具[19-20]，因此提高連鎖圖譜的質(zhì)量顯得尤為重要。圖譜的質(zhì)量主要取決于分子標(biāo)記位點在連鎖群上分布的均勻程度，而均勻程度又受限于標(biāo)記類型，將不同類型的分子標(biāo)記相結(jié)合構(gòu)建圖譜，會顯著提高標(biāo)記在圖譜上分布的均勻程度，并有利于克服不同分子標(biāo)記間的缺陷[21]。例如，金夢陽等[22]通過SRAP、SSR、AFLP和TRAP四種標(biāo)記構(gòu)建了一張包含20個連鎖群，共300個標(biāo)記位點的甘藍型油菜遺傳圖譜，且各標(biāo)記在圖譜的不同連鎖群上分布較均勻。Hashizume等[23]利用477個RAPD標(biāo)記、53個RFLP標(biāo)記及23個ISSR標(biāo)記，構(gòu)建了西瓜的遺傳連鎖圖譜，標(biāo)記位點分布均勻。以上這些標(biāo)記為第一、二代分子標(biāo)記，其最大優(yōu)點是操作簡便、且電泳條帶真實可見，可直接用于作物相關(guān)性狀QTL的精細(xì)定位研究；其不足點是提供的遺傳信息量有限。隨著近年來基因組測序技術(shù)的改進，SNP分子標(biāo)記技術(shù)倍受關(guān)注，該標(biāo)記技術(shù)的主要優(yōu)點是信息檢出量大，易于基因分型；其不足點是SNP等位基因位點在多倍體植物的基因組中的比例具有可變性，很難完成單一型的鑒定，且成本高。

本試驗所用材料為四倍體雜交冰草，基于SRAP標(biāo)記主要對編碼區(qū)進行序列擴增，而SSR標(biāo)記的大部分?jǐn)U增區(qū)域位于非表達區(qū)[24]的特點，同時使用這兩種標(biāo)記技術(shù)對其進行遺傳作圖，可減小標(biāo)記位點在圖譜上分布的不均勻程度。研究表明，SRAP和SSR兩種標(biāo)記位點在四倍體雜交冰草的每個連鎖群上分布較均勻，圖譜整體質(zhì)量有所提高，這為下一步整合AFLP、SRAP和SSR三種標(biāo)記構(gòu)建四倍體雜交冰草的高密度遺傳圖譜奠定了基礎(chǔ)。

偏分離現(xiàn)象被認(rèn)為是生物進化的推動力，在植物界中普遍存在[25]。目前已在大麥[26]、水稻[27]和番茄[28]等作物中發(fā)現(xiàn)了偏分離現(xiàn)象 。偏分離比例會因物種和作圖群體類型的不同而有所變化，有多種因素可造成遺傳標(biāo)記產(chǎn)生不同程度的偏分離現(xiàn)象。Perfectti等[29]認(rèn)為偏分離是由配子體和合子體共同選擇作用引起的；Pawlowshi等[30]的研究表明，環(huán)境因素、基因轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)基因沉默均可能造成偏分離現(xiàn)象的發(fā)生。偏分離標(biāo)記會在一定程度上通過影響標(biāo)記間的距離來影響圖譜的質(zhì)量，植物遺傳作圖時通常要求偏分離標(biāo)記比例小于30%[10]。本試驗得到的475個標(biāo)記中，有389個標(biāo)記符合孟德爾分離規(guī)律，有86個標(biāo)記發(fā)生偏分離，這些標(biāo)記不規(guī)則地分布于14個連鎖群上，各連鎖群的偏分離標(biāo)記比例變幅在13.25～23.81 %之間，平均偏分離比例為18.11 %，可進行四倍體雜交冰草的遺傳作圖。