謝新華,毋修遠(yuǎn)，張 蓓，徐 超，朱鴻帥，郝明遠(yuǎn)

(1.農(nóng)業(yè)部大宗糧食加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450002)

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)又稱納豆膠或多聚谷氨酸，是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺鍵聚合而成的直鏈高分子氨基酸聚合物，分子量一般在10～2 000 kDa左右。γ-PGA具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，如良好的增稠性、保水性、抗凍性等，也因具有可食用性被廣泛應(yīng)用于食品中[1]。Shyu等[2]研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA的添加改善了小麥面團(tuán)流變學(xué)及熱力學(xué)特性，有效提高了面團(tuán)持水率，延緩面包老化。Kumio等[3]研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA的添加可提升酵母的耐凍性，提高酵母細(xì)胞存活率、面制品體系的穩(wěn)定性，且添加1%對(duì)面包的味道及香味無明顯影響。小麥面筋蛋白主要由賦予面筋蛋白黏性性能的醇溶蛋白和賦予面筋蛋白彈性性能的麥谷蛋白構(gòu)成[4]，兩者的功能性質(zhì)對(duì)面團(tuán)品質(zhì)有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，面筋蛋白隨水合程度變化，其流變學(xué)特性、二級(jí)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象等均會(huì)發(fā)生改變[5-7]。本試驗(yàn)擬采用旋轉(zhuǎn)流變儀(DHR)、核磁共振儀(NMR)、傅里葉變換紅外(FITR)、掃描電子顯微鏡(SEM)探究不同γ-PGA添加量對(duì)面筋蛋白水合作用、結(jié)構(gòu)、功能特性的影響，為γ-PGA在面制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

谷朊粉(面筋蛋白)購自河南省蓮花面粉有限公司，蛋白含量為81%。γ-聚谷氨酸購自西安四季生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 面筋蛋白持水率測定

根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別配制濃度為0.00%、0.17%、0.34%、0.50%、0.67%的γ-PGA溶液，取面筋蛋白粉1.0 g，緩慢加入到10 mLγ-PGA溶液中，為避免結(jié)塊，采用漩渦震蕩的方式；混勻后20 ℃靜置3 h；10 000 r·min-1離心15 min，去上清液后稱取質(zhì)量。面筋蛋白的持水率按以下公式[8]計(jì)算：

面筋蛋白的持水率=(M2-M1)/M1×100%

式中M1為面筋蛋白粉質(zhì)量；M2為濕面筋蛋白質(zhì)量。

1.2.2 面筋蛋白水分子存在狀態(tài)測定

水分流動(dòng)性采用上海紐邁公司的MicroMR型核磁共振儀測定，測定其橫向弛豫時(shí)間T2，共振頻率為22 MHz，磁體強(qiáng)度為0.5 T，磁體溫度為32 ℃。參數(shù)設(shè)置如下：90°脈沖時(shí)間P90為17 μs，180°脈沖時(shí)間P180為33 μs，采樣點(diǎn)數(shù)TD為22 290，主頻SW為200 kHz，模擬增益RG1為20，模擬增益RG2為3，累加次數(shù)NS為32，回波個(gè)數(shù)NECH為5 000，回波時(shí)間TE為0.250 ms。

1.2.3 面筋蛋白流變學(xué)特性測定

準(zhǔn)確稱取10.0 g面筋蛋白，采用漩渦震蕩的方式緩慢加入到15 mL不同濃度γ-PGA溶液中，使混合物中γ-PGA濃度分別為0.00%、0.25%、0.50%、0.75%和1.00%，利用美國TA公司DHR-2旋轉(zhuǎn)流變儀，參照Tuhumury等[9]的方法稍作修改，用保鮮膜包裹濕面筋于20 ℃恒溫靜置60 min；切成2 g且大小相同的圓片進(jìn)行小振幅震蕩測試，采用直徑40 mm圓形平板探頭，平板間距為1 mm，頻率范圍為0.1～10.0 Hz(0.63～62.80 rad·s-1)，應(yīng)變振幅為1%。

1.2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測定

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)參考文獻(xiàn)[10]采用傅里葉紅外光譜法測定，傅里葉紅外光譜儀為布魯克科技公司的TENSORⅡ型。將添加不同濃度γ-PGA的濕面筋蛋白(同1.2.3)，利用美國FTS公司Flexi-Dry型冷凍干燥機(jī)冷凍干燥后磨粉，過100目篩后測定。測定參數(shù)：掃描范圍400～4 000 cm-1；掃描256次；分辨率4 cm-1。結(jié)果利用 Omnic 8.2和Peakfit 4.12軟件對(duì)酰胺 I 吸收峰(1 600～1 700 cm-1)進(jìn)行基線校正、高斯去卷積處理和二階求導(dǎo)后曲線擬合，計(jì)算各子峰面積的相對(duì)占比。

1.2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀察

將添加不同γ-PGA濃度的經(jīng)冷凍干燥后的面筋蛋白塊(同1.2.4)掰斷，取中心部位制成5 mm×5 mm×5 mm樣品，用導(dǎo)電膠粘貼于樣品座上，噴金后采用美國FEI公司Quanta FEG 250型場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-PGA對(duì)面筋蛋白持水率的影響

由圖1可以看出，面筋蛋白持水率隨著γ-PGA添加量的增加而顯著增大，0.25%添加量可使面筋蛋白持水率由142%(不添加γ-PGA)升高至153%；添加1% γ-PGA，面筋蛋白持水率較對(duì)照提高了29%，說明γ-PGA能有效提高面筋蛋白的持水率。

2.2 γ-PGA對(duì)面筋蛋白水分遷移的影響

面筋蛋白中水分子的存在狀態(tài)分別為位于0.1～10 ms與蛋白氨基酸殘基結(jié)合最為緊密的強(qiáng)結(jié)合水和弱結(jié)合水(峰1)、位于10～100 ms可凍結(jié)的自由水(峰2)、100～1 000 ms對(duì)應(yīng)的松散水分子(峰3)[11]。弛豫時(shí)間T2的值越高，表明氨基酸與低流動(dòng)性水分子之間關(guān)聯(lián)越弱[12]。由圖2可知，隨γ-PGA濃度增大，面筋蛋白中結(jié)合水與自由水的起峰位置發(fā)生前移。不同峰面積Ai值表示水分占比，低濃度γ-PGA使得松散水分(峰3)的峰面積明顯降低，表明γ-PGA使得面筋蛋白中水分流動(dòng)性降低。從表1可以看出，添加1%的γ-PGA使結(jié)合水A1值由9.52%升高至12.71%，松散水分子A3值從4.27%下降至0.86%，而自由水A2無明顯變化，說明γ-PGA的添加使面筋蛋白中相對(duì)疏松的水分向結(jié)合水轉(zhuǎn)換，更多游離水被面筋蛋白鎖住，導(dǎo)致其持水力增大。

圖中不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Different letters in table mean significant difference at 0.05 level.

圖2 γ-PGA對(duì)面筋蛋白T2的影響Fig.2 Effect of γ-PGA on the T2 of gluten proteins

表1 不同γ-PGA添加量對(duì)面筋蛋白中水分子占比的影響Table 1 Effect of γ-PGA on the ratio of water molecules of unit gluten proteins %

Ai:峰面積/樣品質(zhì)量。
Ai:Peak area/Sample mass.

2.3 γ-PGA對(duì)面筋蛋白流變特性的影響

由圖3可知，被測面筋蛋白的G′、G″均隨振動(dòng)頻率的增大而增加，添加γ-PGA的面筋蛋白G″值均高于對(duì)照，且隨γ-PGA濃度的增加而升高，當(dāng)γ-PGA濃度高于0.75%時(shí)，其G″增大速度變緩；而G′值卻隨γ-PGA濃度增高呈現(xiàn)降低趨勢，表明其面筋彈性減弱。面筋蛋白體系具有類固體性質(zhì)[13]。由圖3看出，隨γ-PGA濃度增大其tanδ呈現(xiàn)增大趨勢，但其tanδ值始終小于1，表明面筋蛋白體系的類固體特性因γ-PGA的添加而減弱，但其類固體性質(zhì)始終沒有改變。

2.4 γ-PGA對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定其功能和性質(zhì)。采用傅里葉紅外圖譜中酰胺Ⅰ帶表征蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，各特征峰與面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系參考文獻(xiàn)[12]。γ-PGA對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如表2所示，未添加γ-PGA時(shí)，面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量為34%，α-螺旋為18%，β-轉(zhuǎn)角為28%，無規(guī)則卷曲為19%。γ-PGA的添加使得面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白聚集形成的分子間β-折疊由11.4%降至10.8%，1 686 cm-1處β-折疊增加0.7%，但β-折疊的峰面積積分總量無顯著差異；α-螺旋由18.7%降至16%，而β-轉(zhuǎn)角卻增加2.5%，并具顯著性差異。結(jié)果表明，γ-PGA的添加導(dǎo)致部分α-螺旋轉(zhuǎn)化成β-轉(zhuǎn)角，說明γ-PGA的添加使得面筋蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而改變了蛋白功能特性。

圖3 γ-PGA對(duì)面筋蛋白動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的影響

2.5 γ-PGA對(duì)面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可以看出，未添加γ-PGA的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中孔洞大小不均勻且平整度較差，大孔徑多在40 μm左右；而添加小于0.5%的γ-PGA使面筋蛋白網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)變得均勻整齊，孔徑多保持在20～25 μm之間；隨著γ-PGA添加量的增加，面筋蛋白網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)分布更加均勻、密集，且孔徑下降至10～15 μm，這可能與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。均勻且較小孔徑的面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可能增強(qiáng)了滯留水分的能力，這可能是面筋蛋白持水性提高的主要因素。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA的添加顯著提升了面筋蛋白持水率。蛋白質(zhì)持水性與其親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)分布有關(guān)，γ-PGA作為高分子陰離子聚合物，其中大量游離羧基會(huì)與水形成氫鍵，導(dǎo)致γ-PGA可吸收超過自重多倍的水[14]；同時(shí)，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物理截留作用與持水率提高存在很大關(guān)系，面筋蛋白和γ-PGA之間可能發(fā)生了相互作用，形成多肽-面筋蛋白復(fù)合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，束縛更多的水分子，從而使得面筋蛋白體系持水率增大[15]。這與Shyu等[2]在小麥面團(tuán)中添加γ-PGA的研究結(jié)果相似。

表2 γ-PGA對(duì)面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of γ-PGA on secondary structures of gluten %

圖4 γ-PGA對(duì)面筋蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響(1 000×)Fig.4 Effect of γ - PGA on the micro structure of gluten proteins(1 000×)

水分分布和存在狀態(tài)的差異對(duì)面筋蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性有重要影響。γ-PGA的添加促使更多的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合水，這可能是因?yàn)棣?PGA作為高分子聚合物，其大量親水殘基在面筋形成過程中形成競爭性吸水，加之γ-PGA良好的增稠性產(chǎn)生水分滯留效果，從而降低了其水分活度，使得面筋蛋白結(jié)合了更多水分子，提升了結(jié)合水含量[16]，Lim等[17]研究也表明γ-PGA的添加可有效控制水分遷移。

隨γ-PGA添加量的增大，面筋蛋白的G′呈下降趨勢，G″呈上升趨勢，可能因?yàn)棣?PGA借助陰離子基團(tuán)與蛋白形成復(fù)合物，使蛋白分子表面覆蓋許多使得蛋白分子間產(chǎn)生排斥力的負(fù)電荷，阻礙了麥谷蛋白分子鏈之間的相互交聯(lián)，避免蛋白質(zhì)聚集[18]，從而降低了面筋蛋白的G′值。G″的提升則是因?yàn)榈鞍拙奂臏p少間接提升了醇溶蛋白的流動(dòng)性，同時(shí)具有強(qiáng)黏性的γ-PGA充當(dāng)一個(gè)吸水性填充物分散在面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[8]，從而提高了面筋蛋白的黏性性能。Baier-Schenk等[19]認(rèn)為，tanδ值越大，面團(tuán)體系中高聚物的含量越少，聚合度越小，本研究 tanδ值的升高也反映出γ-PGA減少了蛋白聚集，導(dǎo)致其彈性性能降低，黏性性能升高。Shyu等[2]也認(rèn)為，添加γ-PGA可以使小麥面團(tuán)黏性更高。

γ-PGA的添加導(dǎo)致部分α-螺旋下降，β-轉(zhuǎn)角上升。這可能是因?yàn)樵谟H水環(huán)境中,維持α-螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的氫鍵受到水分子或親水基團(tuán)的影響，α-螺旋穩(wěn)定性降低導(dǎo)致其含量下降。而面筋蛋白水合作用導(dǎo)致了β-轉(zhuǎn)角的增加，且轉(zhuǎn)化程度與面筋蛋白水合程度及水分分布有關(guān)[20]。面筋蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變表明，γ-PGA在面筋蛋白體系中不僅僅起到了填充物的作用，還與面筋蛋白發(fā)生了相互作用，產(chǎn)生了復(fù)合空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這兩者可能是面筋蛋白持水性、流變特性變化的主要原因[21]。

γ-PGA的添加可有效改善面筋蛋白在速凍及冷凍干燥后形成的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)[22]，使水分在其中的分布更均勻，面筋蛋白也結(jié)合了更多的水，這與持水率的提高和水分遷移的變化結(jié)果保持一致，而面筋網(wǎng)絡(luò)的改善可能與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有密切關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致其流變學(xué)特性發(fā)生改變。