聶淑科 高慧 許繼取 張振濤 張?jiān)式?劉烈剛 張兆輝

作者單位：430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(聶淑科、張振濤、張兆輝)；430030 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科(高慧)；430062 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所(許繼取)；430022 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(張?jiān)式?；430030華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生系(劉烈剛)

原花青素是一種多酚化合物，具有抗腫瘤、抗氧化等生物活性[1]。蓮房原花青素(lotus seedpod procyanidins，LSPC)是蓮房的主要活性成分之一，是一種氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑，具有降低毛細(xì)血管通透性、抗氧化、增強(qiáng)心血管活性等多種生物活性和藥理作用[2-3]。血紅素氧合酶(hemeoxygenase，HO)是血紅素代謝的限速酶，能夠催化血紅素代謝生成膽綠素、Fe2+和一氧化碳(carbon monoxide，CO)。研究證明HO及其催化產(chǎn)物具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細(xì)胞凋亡以及抗血小板聚集的作用[4]。HO包括HO-1、HO-2和HO-3 3種形式同工酶。HO-1基因定位于染色體22q12，又稱為熱休克蛋白32(hot shock protein32，HSP32)，主要分布于外周組織單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的微粒體內(nèi)，血紅素、氧化應(yīng)激、紫外線照射、高溫等各種氧化應(yīng)激因素可明顯誘導(dǎo)其表達(dá)[5]。HO-2基因定位于染色體16p13，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大鼠的前腦、嗅球區(qū)、海馬、中腦、基底節(jié)、丘腦區(qū)、小腦和腦干神經(jīng)元均有強(qiáng)而穩(wěn)定的HO-2表達(dá)[6-7]。二者參與了神經(jīng)損傷修復(fù)和神經(jīng)元退行性變等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理和生理過程。

作者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，LSPC能夠改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)障礙，并通過抑制腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)活性提高腦組織內(nèi)乙酰膽堿(ACh)水平[8]。然而LSPC干預(yù)對(duì)正常衰老所致的老年認(rèn)知功能障礙大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)HO的表達(dá)是否有調(diào)控作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建自然衰老的老化大鼠模型，檢測(cè)其行為學(xué)指標(biāo)并觀察HO-1、HO-2在腦組織中的表達(dá)變化，旨在進(jìn)一步闡明LSPC對(duì)腦衰老的保護(hù)作用及其機(jī)制，為L(zhǎng)SPC在抗衰老方面的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組13月齡健康雌性SD老年大鼠200只，購(gòu)自上海Sippr-BK聯(lián)合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)中心，恒溫〔(24±1)℃〕、晝夜交替(08：00～20：00)條件下給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。4個(gè)月后，從相同動(dòng)物供應(yīng)中心購(gòu)買3月齡年輕雌性SD大鼠40只，相同條件下喂養(yǎng)1個(gè)月，然后行Morris水迷宮進(jìn)行老年認(rèn)知功能障礙大鼠的篩選。喂養(yǎng)期間剔除患呼吸道疾病、感染和腫瘤的大鼠。以40只4月齡年輕雌性SD大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中第3～5天的平均潛伏期為基礎(chǔ)，從200只18月齡雌性SD大鼠中篩選出老年認(rèn)知功能正常(aged unimpaired，AU；其平均潛伏期小于年輕大鼠3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)大鼠和老年認(rèn)知障礙(aged impaired，AI；其平均潛伏期大于年輕大鼠0.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差)大鼠。從40只4月齡年輕SD大鼠中隨機(jī)選取12只作為年輕對(duì)照組，從AU大鼠中隨機(jī)選取12只作為AU組，另隨機(jī)選取36只AI大鼠并隨機(jī)分為AI組、低劑量LSPC干預(yù)組〔50 mg/(kg·d)，以下簡(jiǎn)稱L-LSPC組〕、高劑量LSPC干預(yù)組〔100 mg/(kg·d)，以下簡(jiǎn)稱H-LSPC組〕。

1.2主要材料和儀器LSPC(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)，大鼠HO-1和HO-2酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)LifeSpan BioSciences公司)、Morris水迷宮(Columbus 公司Videomex-v型)、低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、-80℃低溫冰箱(日本SANYO公司)、電動(dòng)勻漿器(美國(guó)Terre Haute公司)、不同規(guī)格微量加樣器(德國(guó)Eppendorf公司)、FA1604電子天平(上海天平儀器廠)由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和公共衛(wèi)生學(xué)院科學(xué)研究公共平臺(tái)提供。

1.3方法

1.3.1給藥干預(yù)：將LSPC采用生理鹽水溶解后，分別按體質(zhì)量50、100 mg/(kg·d)給予L-LSPC組和H-LSPC組大鼠灌胃給藥〔1 mL/(100 g·d)〕，年輕對(duì)照組、AU組和AI組大鼠給予等劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)灌胃給藥8周。

1.3.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：灌胃干預(yù)8周后行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試。Morris水迷宮中水池被劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)象限區(qū)域，將平臺(tái)置于第Ⅲ象限正中距離池壁40 cm處，水面高于平臺(tái)頂1 cm，加入墨汁染色，以從水面無法看見平臺(tái)為準(zhǔn)。首先練習(xí)站臺(tái)，將SD大鼠首先放于平臺(tái)上1 min適應(yīng)性訓(xùn)練后，再將大鼠面向水池池壁從除平臺(tái)所在象限之外的其他3個(gè)象限中分別放入水中1次，記錄90 s內(nèi)SD大鼠從入水到爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即為逃避潛伏期(escaping latency)，如果SD大鼠在90 s內(nèi)能夠找到平臺(tái)，使其在平臺(tái)上停留10 s，同時(shí)記錄潛伏期；若90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則實(shí)驗(yàn)員將其引導(dǎo)至平臺(tái)上同樣停留10 s，將潛伏期記錄為90 s。大鼠從放入池中到找到平臺(tái)所游過的距離，即為游泳距離(swimming distance)。在平臺(tái)停留10 s后間隔3 min再進(jìn)行一次，每天重復(fù)3次，連續(xù)5 d。水池上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡和時(shí)間，并將圖像和數(shù)據(jù)傳輸至計(jì)算機(jī)由Ethovision系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。

1.3.3HO-1和HO-2水平檢測(cè)：完成行為學(xué)測(cè)試后，于冰盤上斷頭處死大鼠，迅速分離大腦皮質(zhì)及海馬，分別用冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精密稱重，加入50 mmol/L冷磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)剪碎，制成5%皮質(zhì)及海馬組織勻漿，分別置-20℃過夜，反復(fù)凍融2次破壞細(xì)胞膜后，以4℃ 3500 r/min(離心半徑=10 cm)離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HO-1與HO-2水平。首先配置標(biāo)準(zhǔn)液以及倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：從試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，以8000 r/min(離心半徑=10 cm)離心30 s，用1 mL樣本稀釋液稀釋，并用槍頭對(duì)準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5次，充分溶解、混勻后，得到標(biāo)準(zhǔn)品S7，給予標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，配置洗滌工作液、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。嚴(yán)格按照大鼠HO-2和HO-1酶聯(lián)免疫試劑盒說明書步驟操作。反應(yīng)終止后5 min內(nèi)，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度〔D(λ)〕值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本HO-1和HO-2水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，各組大鼠Morris水迷宮結(jié)果比較采用重復(fù)測(cè)量的多因素方差分析，分析時(shí)間、分組因素的作用及時(shí)間和分組之間的交互作用(時(shí)間×分組)，對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上5個(gè)分組之間行LSD兩兩比較；各組大鼠HO-1、HO-2表達(dá)水平比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較各組SD大鼠第1～5天逃避潛伏期呈縮短趨勢(shì)，時(shí)間和分組間無交互作用(F時(shí)間=47.278，P時(shí)間<0.01；F組別=13.797，P組別<0.01；F交互作用=1.261，P交互作用=0.222)。AI組大鼠平均潛伏期較年輕對(duì)照組大鼠延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)。L-LSPC組、H-LSPC組第1～5天平均潛伏期也呈縮短趨勢(shì)，H-LSPC組大鼠平均潛伏期與年輕對(duì)照組和AU組大鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，H-LSPC組大鼠第3～5天平均潛伏期明顯短于AI組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

各組SD大鼠第1～5天游泳距離呈縮短趨勢(shì)，時(shí)間和分組間無交互作用(F時(shí)間=15.376，P時(shí)間<0.01；F組別=3.509，P組別=0.008；F交互作用=0.861，P交互作用=0.615)。AU組大鼠第1～5天時(shí)間點(diǎn)游泳距離均大于年輕對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)；第4～5天，L-LSPC組大鼠游泳距離較AI組明顯縮短(P< 0.05)；第3～5天，H-LSPC組大鼠游泳距離短于AI組(P<0.05或P<0.01)，而H-LSPC組大鼠游泳距離與年輕對(duì)照組和AU組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較(±s，n=12，s)

注：AU：老年認(rèn)知功能正常，AI：老年認(rèn)知障礙；L-LSPC：低劑量蓮房原花青素；H-LSPC：高劑量蓮房原花青素；表2～3同。與年輕對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與AI組比較，cP<0.05，dP<0.01

表2 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)游泳距離比較(±s，n=12，cm)

注：與年輕對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與AI組比較，cP<0.05，dP<0.01

表3 各組大鼠皮質(zhì)及海馬HO-1和HO-2水平比較(±s，n=12，ng/mL)

注：與年輕對(duì)照組和AU組分別比較，aP<0.05；與AI組比較，bP<0.01；與L-LSPC組比較，cP<0.01

2.2各組大鼠皮質(zhì)和海馬HO-1和HO-2水平比較各組大鼠皮質(zhì)HO-1和HO-2表達(dá)水平組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。各組海馬組織HO-1和HO-2表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)，與年輕對(duì)照組和AU組比較，AI組大鼠海馬HO-1水平明顯升高(均P<0.01)，而海馬HO-2水平降低(均P<0.05)；與AI組比較，L-HSPC和H-LSPC組海馬HO-1水平降低(均P<0.01)，而海馬HO-2表達(dá)水平升高(P<0.01)，且H-LSPC組升高海馬HO-2水平較L-LSPC組更明顯(P<0.01)。結(jié)果見表3。

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer diseases，AD)是目前最為常見的年齡相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，可供選擇的有效治療手段非常有限，仍不可治愈，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和生活負(fù)擔(dān)[9-10]。研究AD認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型很多，包括有急性膽堿能功能障礙動(dòng)物模型，有基于AD特征性病理產(chǎn)物β淀粉樣蛋白和tau蛋白的眾多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型(如BACE1敲除基因動(dòng)物模型、3XTg-AD動(dòng)物模型等)，遺傳學(xué)模型大多基于家族遺傳性認(rèn)知功能障礙，急性膽堿能功能障礙所致的癡呆在臨床亦不常見，而目前臨床中的癡呆患者多數(shù)為慢性散發(fā)型AD，這也是為何目前有關(guān)AD眾多治療手段在臨床前期無法轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床治療的關(guān)鍵原因[11-12]。本研究選取的SD大鼠為自然衰老的認(rèn)知功能障礙模型，能夠盡可能地模擬占多數(shù)患者的散發(fā)型AD的病情及病理進(jìn)程，旨在為其認(rèn)知功能障礙的干預(yù)治療提供可能的選擇。

HO所涉及的氧化應(yīng)激系統(tǒng)是老化所致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一，神經(jīng)元的氧化應(yīng)激與HO系統(tǒng)的活性特別是HO-1和HO-2蛋白的活性相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞HO-1的過度激活參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程，引起病理性的鐵沉積和能量利用障礙，進(jìn)一步加劇神經(jīng)組織的退行性變[13]；同時(shí)HO-2在神經(jīng)遞質(zhì)即內(nèi)源性CO的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，HO-2能夠維持并改善學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能[14-15]。CO對(duì)于維持長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)至關(guān)重要，HO-2/CO對(duì)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控與年齡相關(guān)學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知障礙密切相關(guān)。Raju等[16]研究發(fā)現(xiàn)位于HO-2基因啟動(dòng)區(qū)域的功能性皮質(zhì)類固醇反應(yīng)元件(glucocorticoid response element，GRE)能夠調(diào)控腦組織HO-2表達(dá)水平，GRE與GRs的結(jié)合可激活HO-2基因的轉(zhuǎn)錄，因此HO系統(tǒng)可以作為癡呆的干預(yù)靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，LSPC具有較強(qiáng)的抗氧化活性[3]，能夠抑制腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng)和年齡相關(guān)的DNA氧化損傷[17]。作者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)LSPC能夠改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)障礙，并通過抑制腦組織AChE活性提高腦組織內(nèi)ACh水平[8]。然而LSPC干預(yù)對(duì)正常衰老所致的老年認(rèn)知功能障礙大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)HO系統(tǒng)的表達(dá)是否有調(diào)控作用尚不得而知。研究發(fā)現(xiàn)，LSPC能夠降低AI大鼠海馬誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)和活性，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元型一氧化氮合酶磷酸化抑制年齡相關(guān)性的NO過表達(dá)，增加海馬NO-sGC-cGMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而改善AI大鼠的認(rèn)知功能[18]。同時(shí)LSPC也可通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶介導(dǎo)的通路活化海馬CREB改善AI大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[19]。Takahashi等[20]在AD的研究中發(fā)現(xiàn)，HO可能與淀粉樣前體蛋白相結(jié)合進(jìn)而抑制HO的活性引起神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果顯示，AI組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)平均潛伏期較年輕對(duì)照組大鼠延長(zhǎng)，游泳距離較年輕對(duì)照組增加，經(jīng)LSPC干預(yù)后，H-LSPC組大鼠3～5 d平均潛伏期明顯短于AI組，游泳距離短于AI組；與年輕對(duì)照組和AU組比較，AI組大鼠海馬HO-1水平明顯升高，海馬HO-2水平降低，給予LSPC干預(yù)能夠降低海馬HO-1表達(dá)水平，增加海馬HO-2表達(dá)水平，提示LSPC可明顯改善老年腦老化大鼠的記憶功能，其機(jī)制可能通過降低大腦海馬組織HO-1水平，上調(diào)HO-2表達(dá)水平來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。LSPC如何調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)HO系統(tǒng)的表達(dá)，是否通過GRE作用于HO-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域，LSPC是否能夠阻斷HO系統(tǒng)與淀粉樣前體蛋白的結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，LSPC對(duì)AD的其他特征性病理改變?nèi)鐃au蛋白的過度磷酸化及神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成有無改善作用，均需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，LSPC可明顯改善老年腦老化大鼠的記憶功能，其機(jī)制可能通過降低大腦海馬組織HO-1水平、上調(diào)HO-2表達(dá)水平來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，提示LSPC作為一種可以通過血腦屏障的藥物，對(duì)老年認(rèn)知功能障礙具有一定改善作用，具備一定的臨床應(yīng)用前景，后續(xù)更多的機(jī)制研究將有助于該藥物的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用。