劉春陽，周偉強

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2016級，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其中雌激素依賴型乳腺癌占大多數(shù)［1］。與激素非依賴型乳腺癌相比，雌激素依賴型乳腺癌通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，引發(fā)基因組和非基因組效應(yīng)以調(diào)控乳腺細胞生長、發(fā)育和凋亡［2］。當ER信號通路發(fā)生失調(diào)時，可導(dǎo)致相關(guān)基因表達失衡或改變細胞質(zhì)內(nèi)蛋白功能，促使乳腺細胞過度增殖或凋亡受阻，從而導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生［3-4］。因此深入研究ER信號通路對揭示乳腺癌的發(fā)病機制以及尋找更有效的乳腺癌治療藥物有重要意義。本文將去乙?；敢种苿㏒AHA（Suberoylanilide Hydroxamic Acid）與乳腺癌ER陽性細胞系MCF-7共同作用，研究乳腺癌細胞在去乙?；癄顟B(tài)下，ER信號通路的變化情況，探討在乳腺癌發(fā)生過程中ER信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與去乙?；揎椫g的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7由本實驗室凍存；RPIM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自美國Thermo公司；固相細胞凋亡抗體芯片試劑盒購自美國R&D公司；人重組Leptin蛋白、SAHA及其它化學(xué)試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)液中，待細胞鋪滿80%左右時用于以下各項實驗。

1.2.2 全細胞蛋白提取 將大約1×107個/ml乳腺癌MCF-7細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，細胞在無血清RPIM-1640培養(yǎng)液中進行同步化處理24 h。加入0.625 nmol/L Leptin和10 μmol/L SAHA與MCF-7細胞孵育24 h。將處理后的MCF-7細胞經(jīng)胰蛋白酶消化，14 000×g離心5 min后取細胞團塊經(jīng)M-PER裂解液裂解。用BSA標準品配制梯度稀釋的蛋白標準品用于標準曲線的繪制。將BCA反應(yīng)液A和B管按50∶1（v∶v）配制反應(yīng)液后，取 25 μl各樣品液與200 μl BCA 反應(yīng)液混合后37℃水浴箱中孵育30 min。應(yīng)用酶標儀在562 nm讀出吸光度（OD）值后根據(jù)標準曲線計算出樣本濃度。

1.2.3 固相細胞凋亡抗體芯片檢測 將已包被抗體的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜加入封閉液中孵育1 h。將200 μg試驗組和對照組蛋白樣品液分別加入試劑盒4孔板各孔中4℃孵育過夜。將偶聯(lián)蛋白樣品的PVDF膜用PBS沖洗后滴加1.5 ml生物素標記的二抗孵育1 h。PVDF膜經(jīng)PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的鏈霉親和素作用30 min。將等體積混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A、B液加在PVDF膜上顯色5 min。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光10 min，采用Gel-pro Analyzer軟件（美國Media Cybernetics公司）計算膜上各抗體標記點的灰度值，以PVDF膜上參照點的灰度值為對照來研究SAHA對MCF-7細胞凋亡蛋白表達的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAHA抑制乳腺癌細胞周期G1-S期調(diào)控因子的表達 固相細胞凋亡抗體芯片結(jié)果顯示，與空白對照組相比，SAHA顯著增強MCF-7細胞中Bax、p21CIP1和 p27KIP1蛋白的表達，并抑制 Survivin蛋白的表達；Leptin則抑制Bax、p21CIP1和 p27KIP1蛋白的表達，增加Survivin蛋白的表達。見圖1。

2.2 SAHA對乳腺癌細胞凋亡蛋白表達的影響 固相細胞凋亡抗體芯片結(jié)果顯示，與空白對照組相比，SAHA處理后MCF-7細胞內(nèi)Capase-3、TRAIL DR5的表達水平顯著上升，而Claspin、Clusterin和XIAP的表達水平明顯下降。而Leptin則抑制MCF-7細胞中Caspase-3、TRAIL DR5蛋白的表達，增加Claspin、Clusterin和XIAP蛋白的表達水平。見圖2。

3 討論

有研究表明，以SAHA為代表的HDAC抑制劑有明顯的促使腫瘤細胞生長停滯、誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡的特性。其具有抗癌的廣譜性、特異性，并具有毒性較低的特點，是一類具有良好應(yīng)用前景的抗癌新藥［5］。ER陽性乳腺癌是一種雌激素依賴性腫瘤，雌激素的作用是由ER介導(dǎo)的，在基因水平上ER受其上下游相關(guān)基因調(diào)控。相關(guān)研究表明，ER基因及其調(diào)控基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6］。因此，本研究選取ER陽性乳腺癌細胞MCF-7，利用固相細胞凋亡抗體芯片研究SAHA對MCF-7細胞增殖影響的分子機制。

圖1 SAHA對乳腺癌MCF-7細胞周期調(diào)控蛋白表達的影響

圖2 SAHA誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡蛋白的表達

從本實驗結(jié)果中可以看出，SAHA顯著增強MCF-7細胞中調(diào)控細胞周期G1-S期的p21CIP1和p27KIP1蛋白的表達，并抑制Survivin的功能；另外SAHA還增加了細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、TRAIL DR5和Capase-3的表達水平，對Claspin、Clusterin和XIAP的表達水平明顯下降。Bax作為一種重要的凋亡促進因子通過形成二聚體而抑制凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-x的表達［7］。而Survivin作為重要的凋亡抑制因子，可直接抑制Caspase活性，促進癌細胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［8］。XIAP（X-linked inhibitor of apoptosis protein）是凋亡抑制蛋白家族成員，同樣也是通過抑制Caspase分子的活性而對細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用［9］。Clusterin可通過與細胞質(zhì)中Bax共同作用抑制細胞色素C的釋放而達到保護細胞的目的［10］。Claspin作為ATR依賴的DNA復(fù)制限制點調(diào)控重要的調(diào)節(jié)子，參與細胞周期S期DNA復(fù)制過程中復(fù)制叉的延長和穩(wěn)定［11］。p21CIP1和 p27KIP1作為細胞周期重要的負調(diào)節(jié)因子，可抑制細胞周期調(diào)控系統(tǒng)中Cyclin D1-CDK4和Cyclin E-CDK2的表達，使細胞周期停滯在G0/G1期［12-14］。

綜上所述，SAHA通過調(diào)控細胞周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達而達到抑制乳腺癌細胞增殖的目的。