王 寧，侯 敏，房世杰，艾尼江·爾斯?jié)M，侯新強，楊 蓉，包慧芳

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研管理處，烏魯木齊 830016)

0 引 言

【研究意義】植物在其生長發(fā)育過程中遭受其它生物侵染或非生物的不利因素影響，使其生長發(fā)育受到阻礙，導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差甚至植株死亡的現(xiàn)象稱為植物病害。長期以來，頻繁使用化學(xué)殺菌劑使植物病原菌在易產(chǎn)生抗藥性的同時還會造成環(huán)境污染。因此，植物病害的防治措施正逐漸從單純依賴化學(xué)防治轉(zhuǎn)向與環(huán)境友好、經(jīng)濟效益較高的生物防治協(xié)同調(diào)控，篩選性能優(yōu)良、穩(wěn)定性好的微生物菌種目前也成為植物保護領(lǐng)域的研究熱點[1-3]?！厩叭搜芯窟M展】多粘類芽孢桿菌( Paenibacillus polymyxa) 具備產(chǎn)生肽類、蛋白質(zhì)類、核苷類等多種抗菌物質(zhì)的優(yōu)良特性[4-6]，并可以從根際土壤向植物根部移動定植，是一種兼具防病和促生作用的生防菌[7]。芽孢具有耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑等特性，是菌劑應(yīng)用的理想劑型[9]。為后續(xù)田間試驗奠定基礎(chǔ)急需解決本菌劑在制備過程中存在的發(fā)酵菌落數(shù)偏低、芽孢生成率較低等問題，但優(yōu)化培養(yǎng)基組成是一個長期復(fù)雜的過程，會涉及大量的數(shù)據(jù)分析處理。響應(yīng)面分析是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù)，采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型，已被成功應(yīng)用于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗[10,11]。【本研究切入點】從新疆紅棗黑斑病高發(fā)棗園土壤中分離到一株高效拮抗細菌JK1，鑒定為多粘類芽孢桿菌，生測結(jié)果表明，該芽孢桿菌能顯著抑制鏈格孢屬病原真菌生長，具有廣譜的抗菌活性[8]。研究采用響應(yīng)面法對紅棗黑斑病的拮抗細菌JK1培養(yǎng)基進行優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對多粘類芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基進行優(yōu)化，利用響應(yīng)面法，對影響產(chǎn)芽孢過程的培養(yǎng)基因子水平及其交互作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種

多粘類芽孢桿菌(JK1) 由實驗室保存。

1.1.2 主要儀器、試劑

MSSPX-250 型生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，MLS-3020 高壓蒸汽滅菌鍋，pHS-3C 酸度計，恒溫搖床，島津電子天平，控溫水浴鍋。

麥芽浸粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化鈉(NaCl)、硫酸鎂( MgSO4)、磷酸二氫鉀( KH2PO4)、瓊脂等。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基( LB 培養(yǎng)基) : 牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 10 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基: 葡萄糖 10 g，酵母粉10 g，NaCl 1 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)

1.2.1.1 菌種活化

將已保存的多粘類芽孢桿菌菌種接至活化培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h備用。

1.2.1.2 種子液制備

取一環(huán)活化菌種，接入裝有200 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，35℃,150 r/min培養(yǎng)16 h。

1.2.1.3 搖瓶培養(yǎng)[12]

分別取4 mL種子液接入裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(接種量為2%)。置35℃150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，進行后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化研究。

1.2.2 芽孢率測定

將菌液培養(yǎng) 24 h 后，每隔4 h 測定一次活菌數(shù)及芽孢數(shù)，確定最佳培養(yǎng)時間。芽孢率的測定方法為:80℃ 水浴加熱 15 min 后，用稀釋涂布法檢測芽孢生成量。

1.2.3 抑菌圈測定[13]

制作PDA雙層培養(yǎng)基，上層加入紅棗黑斑病病原菌，利用牛津杯法測定效價。具體方法為：發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取50 μL上清液加入牛津杯，28℃培養(yǎng)4 d后十字交叉法測抑菌圈直徑。

1.2.4 最佳碳源確定

用1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉、玉米粉和麥芽浸粉作為菌株碳源，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，35℃,150 r/min培養(yǎng)48 h，80℃水浴后用稀釋涂布法檢測芽孢生成量。

1.2.5 最佳氮源確定

用1%的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀作為菌株氮源，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，35℃,150 r/min培養(yǎng)48 h，80℃水浴后用稀釋涂布法檢測芽孢生成量。

1.2.6 Plackett-Burman試驗

應(yīng)用設(shè)計軟件，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要成分(6個實際因素)，5個虛擬因素進行試驗分析，采用試驗次數(shù)N = 12的Plackett-Burman設(shè)計，對11個因素進行考察，響應(yīng)值 Y 為菌體芽孢數(shù)。將各因素顯著性排序，從而得到影響菌體芽孢數(shù)的3個主效應(yīng)因素。

1.2.7 最陡爬坡試驗

通過Plackett-Burman設(shè)計確定影響菌株產(chǎn)芽孢的顯著性因素，然后通過各顯著性因素的正負效應(yīng)決定下一步最陡爬坡實驗的爬坡路徑，包括變化方向和變化的步長，在有限實驗次數(shù)內(nèi)快速逼近曲面的穩(wěn)定點區(qū)域。

1.2.8 響應(yīng)面分析

根據(jù)二水平設(shè)計結(jié)果，選出影響最大的三個因素作為考察因素，采用 Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計，各取3水平，設(shè)計14個實驗點，其中12個分析點，2個為對照，進行響應(yīng)曲面分析方法對培養(yǎng)成分進行優(yōu)化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析由Design-Expert8.05軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳源確定

碳源是菌體碳架構(gòu)成及能量供應(yīng)的來源。常用速效碳源及長效碳源對JK1芽孢產(chǎn)量的影響。48 h后檢測芽孢生成量，研究表明，麥芽浸粉為最適碳源，其次效果較好的依次為葡萄糖、果糖及可溶性淀粉。進入發(fā)酵穩(wěn)定期后，麥芽浸粉最利于JK1芽孢數(shù)量的積累，但速效碳源通常會使菌體營養(yǎng)生長階段較快完成，且葡萄糖發(fā)酵的芽孢生成量也較高，因此，將葡萄糖及麥芽浸粉確定為JK1芽孢生成的速效碳源及長效碳源用于后續(xù)實驗。圖1

圖1 不同碳源下JK1產(chǎn)芽孢變化

Fig.1 Influence of different carbon sources on the spore production of JK1

2.2 最佳氮源確定

選擇1%的牛肉膏、酵母粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀作為菌株氮源，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。研究表明，有機氮源富含各種氨基酸和微量元素，對菌體生長代謝可能有較大促進作用，明顯有利于JK1芽孢的生成，無機氮源下芽孢幾乎無生長或生長緩慢，經(jīng)測定，大豆蛋白胨為氮源時JK1芽孢生長最佳。圖2

圖2 不同氮源下JK1產(chǎn)芽孢變化

Fig.2 Influence of different nitrogen sources on the spore production of JK1

2.3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計優(yōu)化

通過兩水平的Plackett-Burman 試驗設(shè)計，進行一階優(yōu)化。選用實驗次數(shù) N=12的實驗設(shè)計，對麥芽浸粉(X1)、葡萄糖(X2)、大豆蛋白胨(X3)、NaCl(X4)、K2HPO4(X5) 、MgSO4(X6)6個因素進行考察，每項均取高(1)、低(-1)2水平，響應(yīng)值為多粘類芽孢桿菌芽孢數(shù) (Y)。表1

利用Design expert軟件對PB實驗進行方差分析，JK1各因素影響結(jié)果顯示。麥芽浸粉、葡萄糖、NaCl的P值分別為0.000 2、0.048 5、0.033 5均小于0.05，說明麥芽浸粉、葡萄糖、NaCl對JK1產(chǎn)芽孢的影響顯著。其它3個因素P值均大于0.05，說明對JK1產(chǎn)芽孢影響不顯著，后續(xù)培養(yǎng)基優(yōu)化取平均值。表2

表1 Placket-Burman 設(shè)計

Table 1 Plackett-Burman design

試驗號GroupingX1X2X3X4X5X6芽孢Spore count111-11-1-120.72111-1-1-119.33-1-1-1-1-1-118.441-1-1-11-121.151-11-11121.66-1-1111-118.47-111-1-1115.8811-111121.39-11-1-11117.910-11111-118.111-1-1-11-1118.0121-111-1120.6

表2 Plackett-Burman 設(shè)計因素水平及顯著性

Table 2 Plackett-Burman design factor and significance level

因素Element (g/L)水平 Level-11系數(shù)估計Coefficient estimateF值F ValueP值Prob>F重要性O(shè)rderX1麥芽浸粉10156.0087.280.000 21X2葡萄糖11.5-16.676.730.048 53X3大豆蛋白胨1015-1.203.490.120 64X4NaCl11.518.678.450.033 52X5K2HPO40.20.350.002.420.180 25X6MgSO40.50.75-5.330.170.695 26

2.4 最陡爬坡實驗

由 Plackett-Burman 實驗可知，在待優(yōu)化培養(yǎng)基中，麥芽浸粉、NaCl、葡萄糖這3個因素對產(chǎn)孢有重要的影響，培養(yǎng)基中各變量的系數(shù)估計值，該系數(shù)決定了爬坡的方向。其中麥芽浸粉和NaCl有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；葡萄糖有顯著負效應(yīng)，應(yīng)減小。根據(jù)3個因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定步長進行實驗。最優(yōu)培養(yǎng)條件在處理3與處理4之間，故以處理4的條件，即麥芽浸粉(A)22.5 g/L、葡萄糖(B)0.6 g/L、NaCl(C)3 g/L為響應(yīng)面實驗的中心點。表2，表3

表3 最陡爬坡實驗

Table 3 Design and results of the steepest slope experiment

試驗號GroupingX1(g/L)X2(g/L)X3(g/L)芽孢數(shù)Spore count115.01.20.519.66217.51.0121.77320.00.8228.07422.50.6333.25525.00.4429.72

表4 響應(yīng)面因素水平

Table 4 Analysis factor levels of response surface methodology

水平Level因素 ElementABC-1 Low200.420 Center22.50.631 High250.84

2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計確定顯著影響因子最佳值

采用Box-Benhnken 的中心組合實驗設(shè)計，建立3因素 3水平的響應(yīng)面分析實驗，共15個實驗點。給出的實驗結(jié)果顯示，15個實驗點可以歸分為2類，一類為析因點，即自變量取值在A、B、C三項構(gòu)成的三維頂點上，共有12個析因點；第二類為零點，即區(qū)域的中心點，零點試驗要重復(fù)3次，用來判定試驗誤差[14]。以芽孢產(chǎn)生量為響應(yīng)值，根據(jù)表5的試驗結(jié)果進行多元回歸分析。經(jīng)回歸擬合后，實驗因子對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為：Y=45.00+5.14A-1.00B -1.89C+0.053AB- 0.35AC+0.085BC-2.31A2-2.82B2-3.42C2。表4，表5

表5 響應(yīng)面試驗

Table 5 Design and results of response surface methodology

試驗號GroupingABC芽孢數(shù)Actual value預(yù)測值Predicted value10-1137.4637.7721-1045.3545.96301135.2835.94401-139.8739.56500045.3045.00600045.0445.007-10-134.7435.66810143.0942.17911043.8044.06100-1-142.3941.731110-146.6046.651200044.6545.0013-11034.2833.6714-10132.6332.5815-1-1036.0435.78

表6 響應(yīng)面試驗方差

Table 6 variance analysis of response surface methodology

試驗號Grouping自由度df平方和Sum of Squares均方Mean SquareFP模型 Model9329.4136.6047.180.000 3A1211.67211.67272.81< 0.000 1B18.028.0210.340.023 6C128.6528.6536.930.001 7AB10.0110.0110.0140.909 8AC10.490.490.630.462 8BC10.0290.0290.0370.854 6A2119.6519.6525.330.004 0B2129.4129.4137.900.001 6C2143.3043.3055.810.000 7失擬Lack of Fit33.671.2211.410.081 6

3D圖形可形象展示響應(yīng)值和實驗參數(shù)水平之間的關(guān)系，通過上述回歸方程作響應(yīng)曲面圖形?？芍?dāng)一個實驗因子變量濃度不變時，響應(yīng)值均會隨另兩個變量濃度的增大呈現(xiàn)先增后減趨勢，且曲面存在最高穩(wěn)定點。根據(jù)方程求一階偏導(dǎo)得Y的極大值是在：A=1.000，B=-0.174，C=-0.329，也就是麥芽浸粉、葡萄糖、NaCl分別為25.00 g/L、0.57 g/L、2.7 g/L時多粘類芽孢桿菌JK1產(chǎn)芽孢數(shù)量為4.83×109CFU/mL。在該條件下，對模型預(yù)測值進行實驗驗證，重復(fù)三次后平均結(jié)果為4.92×109CFU/mL，說明該實驗選用的模型是合理的。圖3～5

圖3 麥芽浸粉和葡萄糖濃度對芽孢產(chǎn)量影響的響應(yīng)面

Fig.3 Response surface map of malt extract and glucose concentration on the yield of spore

圖4 麥芽浸粉和NaCl濃度對芽孢產(chǎn)量影響的響應(yīng)面

Fig.4 Response surface map of malt extract and NaCl concentration on the yield of spore

圖5 葡萄糖和NaCl濃度對芽孢產(chǎn)量影響的響應(yīng)面

Fig.5 Response surface map of glucose and NaCl concentration on the yield of spore

2.6 優(yōu)化后發(fā)酵液的抑菌效果

優(yōu)化前發(fā)酵液抑菌圈直徑為24.5 mm，優(yōu)化后發(fā)酵液抑菌圈直徑為30 mm。優(yōu)化后較優(yōu)化前增加22.4%，證明優(yōu)化后的發(fā)酵液不僅提高芽孢生成率還產(chǎn)生了更多抑菌物質(zhì)。圖6

圖6 優(yōu)化前(左)、后(右)的發(fā)酵液拮抗效果

Fig.6 Contrast of antagonistic effect before(left)and after(right)optimization

3 討 論

安全、無污染的有益微生物農(nóng)藥、肥料等農(nóng)業(yè)投入品的研究正逐漸受到人們重視[15]。研究表明，生防細菌JK1在離體條件下對棗樹黑斑病病原菌可產(chǎn)生明顯抑制效果，在新疆林果業(yè)極具應(yīng)用前景。但考慮到生防因子的復(fù)雜性，后續(xù)還要完善拮抗賦分系統(tǒng)，結(jié)合定殖力、產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、噬鐵素等能力高效篩選優(yōu)良生防菌株。

由于芽孢沒有新陳代謝，能經(jīng)受多種環(huán)境傷害，具有廣闊的應(yīng)用前景。著重關(guān)注JK1產(chǎn)芽孢的能力，而目前對產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基的報道并不多見。從高度非線性、非結(jié)構(gòu)化的復(fù)雜系統(tǒng)中要獲得最佳工藝，試驗優(yōu)化技術(shù)具有很重要的作用[,16,17]。響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法通過擬合多因素與響應(yīng)值間的全局函數(shù)關(guān)系，有助于快速建模，搖瓶條件下使JK1的產(chǎn)芽孢能力提高3.4倍，通過后期的發(fā)酵驗證，表明該方法不僅可以縮短優(yōu)化時間，應(yīng)用可信度也較高。

4 結(jié) 論

通過單因素實驗確定了JK1產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基的最佳長效碳源、速效碳源及氮源分別為：麥芽浸粉、葡萄糖、大豆蛋白胨。利用響應(yīng)面法分三個步驟對JK1的搖瓶培養(yǎng)基進行優(yōu)化。利用Plackett-Burman試驗設(shè)計法確定影響產(chǎn)芽孢培養(yǎng)的主要營養(yǎng)要素，用最陡爬坡法確定主要因素的中心點，接著采用BBD中心組合實驗確定JK1發(fā)酵主要因素的最佳水平。對中心組合實驗結(jié)果進行分析，利用因素系數(shù)建立二次回歸方程，由一階偏導(dǎo)得出因素極大值，確定JK1最佳產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基組成：麥芽浸粉 25.00 g/L、葡萄糖 0.57 g/L、大豆蛋白胨 12.5 g/L、NaCl 2.7 g/L、K2HPO40.25 g/L 、MgSO40.625 g/L。最優(yōu)產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基可將JK1的芽孢數(shù)從初始的1.12×109CFU/mL提高到4.92×109CFU/mL。