王玉凱，趙 歡，牛建新

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨是薔薇科植物、梨屬中的新疆梨種(Pyrussinkiangensisyu)。受遺傳特性的影響，庫爾勒香梨的果實(shí)萼片存在兩種情況，即脫落與宿存，萼片的宿存形成宿萼果，大量的宿萼果導(dǎo)致果實(shí)果形不規(guī)則，嚴(yán)重影響果實(shí)的口感、外觀與品質(zhì)，致使庫爾勒香梨降低其商品價(jià)值和市場競爭力。從分子水平研究庫爾勒香梨kfpSPL基因與萼片脫落和宿存之間的關(guān)系，對提高庫爾勒香梨果實(shí)的品質(zhì)及外觀有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，關(guān)于庫爾勒香梨萼片的發(fā)育規(guī)律及其萼片脫落過程中相關(guān)內(nèi)激素的變化規(guī)律已有相關(guān)報(bào)道[1,2]。前人研究表明，庫爾勒香梨的脫萼和宿萼差異表達(dá)的眾多片段中有兩條與蘋果中的轉(zhuǎn)錄因子有較高的同源性[3，4]。此外，孫曉霞等[5]運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)獲得庫爾勒香梨脫萼組和宿萼組代表樣品的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，篩選出脫萼組和宿萼組樣品的差異表達(dá)基因并且獲得了相應(yīng)基因的功能注釋。在王博慧等[6]的研究中發(fā)現(xiàn)，通過克隆技術(shù)得到了kfpMYB及其啟動(dòng)子，并對已獲得的上游序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。在植物開花調(diào)控過程中SPL轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義，控制植物開花的光周期誘導(dǎo)途徑和赤霉素誘導(dǎo)途徑[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以往對于庫爾勒香梨脫萼和宿萼的研究主要集中在生理研究層面，如植物生長調(diào)節(jié)劑[8]、形態(tài)[1]、修剪[9]、光照[10]、授粉[11]等生理因素對庫爾勒香梨萼片脫落與宿存的研究。作為調(diào)控基因的重要組成部分，啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)時(shí)間和程度，它是一段特定的DNA序列，可與RNA聚合酶識別、結(jié)合及起始轉(zhuǎn)錄。研究庫爾勒香梨萼片脫落與宿存的分子機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆kfpSPL基因的全長基因組DNA序列及其啟動(dòng)子，了解該基因如何應(yīng)答激素和環(huán)境條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

4月中旬在新疆庫爾勒市沙依東園藝場五分場，標(biāo)記3株樹齡為10a的庫爾勒香梨樹作為試驗(yàn)樹，于盛花期(全樹50%花朵開放)，采集標(biāo)記庫爾勒香梨樹的全花(花梗以上部分)，三棵試驗(yàn)樹各30朵花，去除花瓣并將剩余部分從萼片和子房交界處分割成兩部分，分別用錫箔紙包好，迅速投入液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 庫爾勒香梨kfpSPL的基因組DNA克隆

以天根公司新型植物基因組小型提取試劑盒說明書為依據(jù)進(jìn)行庫爾勒香梨基因組DNA的提取。使用試驗(yàn)已獲得的庫爾勒香梨kfpSPL基因的cDNA序列及梨基因組信息為模板設(shè)計(jì)引物。上游引物為SPL1-S為5‘-TTGCTGCCTCCTACCCTG-3’，下游引物為SPL1-A為5‘-ACTTGCCAAACTAAACATC-3’。以庫爾勒香梨基因組DNA序列為模板進(jìn)行kfpSPL基因組DNA序列的擴(kuò)增。其PCR反應(yīng)體系為：10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Plus)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL，模板1 μL，上下游引物(20 μmol/L)1μL，LATaq酶(5 U/μL)0.25 μL，滅菌蒸餾水加至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s；51℃退火30s；72℃延伸2 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中、使用麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，通過菌液PCR篩選陽性克隆產(chǎn)物，將菌液PCR擴(kuò)增的陽性克隆產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN進(jìn)行分析。

1.2.2 kfpSPL啟動(dòng)子片段的克隆

使用SPL基因cDNA全長與梨基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得SPL基因上游啟動(dòng)子參考序列。利用參考序列設(shè)計(jì)引物，以庫爾勒香梨基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得庫爾勒香梨SPL基因上游約2 000 bp的序列。上游引物為SPL1-QDZ-S為5’-AAGGGCATGAACCATACGTACC-3’,下游引物為SPL1-QDZ-A為5’-TACCTGCCTTTAGCAGCGTT-3’。PCR反應(yīng)體系同上，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45s；53℃退火30s；72℃延伸2 min；30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段連接到pEASY-T1克隆載體上，將已獲得的重組質(zhì)粒交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用DNAMAN進(jìn)行分析。

1.2.3 序列分析

將測序得到的kfpSPL基因組DNA序列和啟動(dòng)子序列在梨全基因組序列數(shù)據(jù)庫(http：//peargenome.njau.edu.cn)中進(jìn)行比對，再在植物順式調(diào)控元件數(shù)據(jù)庫PLACE和PlantCare(http://bio_informatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中對啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 kfpSPL基因的基因組DNA序列的克隆

使用引物SPL1-S和SPL1-A從庫爾勒香梨基因組DNA中擴(kuò)增得到長度約為3 000 bp的片段，該片段經(jīng)過克隆、菌液PCR驗(yàn)證、挑選出陽性克隆，測序得到該片段長度為3 320 bp，與該基因的cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)包含三段內(nèi)含子，總長度為1 728 bp，第一段內(nèi)含子位于基因組DNA的第407～949 nt處，第二段內(nèi)含子位于第962～2 386 nt處，第三段內(nèi)含子位于第2 530～2 673 nt處。

將獲得的kfpSPL基因的基因組DNA序列在梨全基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該基因組DNA與Pyrus bretschneideri 數(shù)據(jù)庫中的一段序列的同源性為99%，且二者長度相同，E值為0，該序列位于scaffold291.0中301 708～305 026 nt的位點(diǎn)上，而另一段與Pyrus bretschneideri 數(shù)據(jù)庫中的一段序列的同源性為85%，且二者長度相同，E值為2.7，該序列位于scaffold291.0中300 845～300 878 nt的位點(diǎn)上。圖1

圖1 kfpPL基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

Fig.1 PCR production of kfpSPL gDNA(A)

2.2 kfpSPL基因啟動(dòng)子序列克隆

用kfpSPL基因的cDNA全長序列與梨基因組序列進(jìn)行比對，獲得kfpSPL基因上游啟動(dòng)子參考序列，根據(jù)比對后獲得的啟動(dòng)子參考序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)克隆獲得上游啟動(dòng)子序列，經(jīng)測序表明啟動(dòng)子長為2 332 bp。將克隆得到的啟動(dòng)子序列在梨全基因組序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)克隆得到的上游啟動(dòng)子序列的1～796 nt和1 042～2 332 nt分別與scaffold291.0中290 783～289 988 nt和289 990～288 701 nt的同源性為96%和97%，E值均為0。說明kfpSPL基因啟動(dòng)子序列與碭山梨scaffold291.0啟動(dòng)子序列存在一定的差異。其中位于kfpSPL基因的啟動(dòng)子序列的第797～1 041 nt處與梨全基因組數(shù)據(jù)庫中未有比對上的相同序列，可能是因?yàn)閹鞝柪障憷媾c碭山梨的品種間差異造成的。在kfpSPL基因的啟動(dòng)子序列的第161～162 nt處發(fā)生插入突變，在1 345～1 350 nt處發(fā)生插入突變，在1 375～1 377 nt處發(fā)生插入突變，在2 129～2 137 nt處發(fā)生插入突變。并且在序列中多處有單堿基突變發(fā)生。圖2

2.3 kfpSPL基因啟動(dòng)子序列

通過生物信息學(xué)分析kfpSPL基因的上游啟動(dòng)子序列，其預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及其功能。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，庫爾勒香梨kfpSPL基因的啟動(dòng)子序列中的TATA-box和CAAT-box基本轉(zhuǎn)錄原件也存在于其他多數(shù)啟動(dòng)子中，并分別位于kfpSPL基因啟動(dòng)子序列上的多個(gè)位點(diǎn)，從預(yù)測中還發(fā)現(xiàn)一些順式調(diào)控元件，其中高轉(zhuǎn)錄水平的順式調(diào)控作用元件為5UTR Py-rich stretch，與光調(diào)控相關(guān)的順式作用元件ACE、Box 4、 Box II、G-box、CATT-motif和TCT-motif，與脅迫相關(guān)的順式作用調(diào)控元件有ARE、TC-rich repeats、WUN-motif，與脫落酸響應(yīng)有關(guān)的順式作用調(diào)控元件是ABRE，與赤霉素響應(yīng)有關(guān)的順式調(diào)控作用元件是GARE-motif、P-box，與水楊酸響應(yīng)有關(guān)的順式調(diào)控作用元件是TCA-element，與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件是CAT-box，與茉莉酸響應(yīng)有關(guān)的順式作用調(diào)控元件是CGTCA-motif、TGACG-motif，與胚乳表達(dá)所需的順式作用調(diào)控元件是Skn-1_motif，MYB結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)MYB的調(diào)控元件是MBS。這些調(diào)控元件的存在說明kfpSPL基因受多種外界信號的調(diào)控，例如激素、光、脅迫等。通過一系列的生物學(xué)過程來調(diào)控kfpSPL基因特定的轉(zhuǎn)錄過程。庫爾勒香梨kfpSPL基因的啟動(dòng)子含有赤霉素、水楊酸、脫落酸等較為常見的順式作用元件，可以推斷赤霉素、水楊酸、脫落酸等激素可能會調(diào)控kfpSPL基因的表達(dá)。表1，圖3

圖2 kfpSPL基因gDNA的PCR擴(kuò)增

Fig.2 PCR production of kfpSPL promoter(B)

表1 應(yīng)用 PLACE 和 Plant CARE 在線預(yù)測的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件

Table 1 cis-acting regulatory elements analysis of promoter sequences by PLACE and plant CARE

調(diào)控序列名稱Regulatory sequence name位置(鏈)Location(chain)序列Sequence位點(diǎn)功能Fuction of site5’UTR Py-rich stretch-432TTTCTTCTCT高轉(zhuǎn)錄水平的順式作用元件cis-acting element conferring high transcription levelsAAGAA-motif-193GAAAGAABRE+1 155GCCACGTACA順式作用元件參與脫落酸的反應(yīng)cis-acting element involved in the abscisic acid responsivenessACE+910ACGTGGA光響應(yīng)中的順式作用元件cis-acting element involved in light responsivenessARE+108;-1 204;+1 020TGGTTT厭氧誘導(dǎo)必需的順式作用調(diào)控元件cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionAT-rich element+536ATAGAAATCAA在豐富的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)(atbp-1)binding site of AT-rich DNA binding protein (ATBP-1)ATGCAAAT motif+365ATACAAAT順式調(diào)控元件相關(guān)聯(lián)的tgagtca模體cis-acting regulatory element associated to the TGAGTCA motifBox 4-916;-927ATTAAT參與光響應(yīng)的保守DNA模塊的一部分part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Box II+1 266TGGTAATAA光響應(yīng)元件的一部分part of a light responsive elementCAAT-box+42等42個(gè)位點(diǎn)+42 ect,42sitesCAAT,CAATT,CCAAT啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)的共同順式作用元件common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCAT-box+1 155GCCACT與分生組織表達(dá)相關(guān)的順式作用調(diào)控元件cis-acting regulatory element related to meristem expressionCATT-motif-1 352GCATTC光響應(yīng)元件的一部分part of a light responsive elementCGTCA-motif-1 478CGTCA順式調(diào)控元件參與茉莉酸響應(yīng)cis-acting regulatory element involved in the JAMe-responsivenessCTAG-motif+339ACTAGCAGAAAG-box+117;-678;-156;-678;-909CACATGG,TAAACGTG,CACGTC,CACGTT順式作用調(diào)節(jié)元件參與光響應(yīng)性cis-acting regulatory element involved in light responsivenessGARE-motif+144AAACAGA赤霉素響應(yīng)元件gibberellin-responsive elementMBS+28;+1 272;-1 064GAACTG,TAACTGMYB結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)MYB binding site involved in drought-inducibilityP-box+1431GCCTTTTGAGT赤霉素響應(yīng)元件gibberellin-responsive elementSkn-1_motif+662GTCAT胚乳表達(dá)所需的順式作用調(diào)控元件cis-acting regulatory element required for endosperm expressionTATA-box+15等28個(gè)位點(diǎn)+15 etc,28 sitesTATTTAAA,TATAAA,TATATAA,TATA,ATATAT,TATATAAATC,TTTTA核心啟動(dòng)子元件約30轉(zhuǎn)錄起始core promoter element around -30 of transcription startTC-rich repeats-434;-606ATTTTCTTCA防御和應(yīng)激反應(yīng)中的順式作用元件cis-acting element involved in defense and stress responsivenessTCA-element-874GAGAAGAATA水楊酸反應(yīng)中的順式作用元件cis-acting element involved in salicylic acid responsivenessTCCACCT-motif+528TCCACCTTCT-motif+1 097TCTTAC光響應(yīng)元件的一部分part of a light responsive elementTGACG-motif+1 478TGACG順式調(diào)控元件參與茉莉酸響應(yīng)cis-acting regulatory element involved in the JAMe-responsivenessUnnamed__1+911CGTGGUnnamed__3+911CGTGGUnnamed__4+217等12個(gè)位點(diǎn)+217 etc12sitesCTCCWUN-motif-899TCATTACGAA創(chuàng)傷響應(yīng)元件wound-responsive element

圖3 kfpSPL啟動(dòng)子序列TATA-BOX,CAAT-BOX(灰色標(biāo)出)，部分預(yù)測順式作用元件(黃色標(biāo)出)

Fig.3 Sequence of kfpSPL gene promoter TATA-BOX and CAAT-BOX are black arrow.Part of the predicted cis-acting element is marked with a highlighted box

圖4 kfpSPL基因組DNA序列，翻譯起始密碼子(紅色粗體標(biāo)出)，內(nèi)含子(紅色字體標(biāo)出)，外顯子(黑色字體)

Fig.4 Sequence of kfpSPL genomic DNA. The initial password of the translation is marked in bold red, The introns are highlighted in red, and the black font is exon

3 討 論

前人研究表明，庫爾勒香梨的脫萼果主要于初花期至盛花期形成，于末花期減弱[12],表明花期決定著果實(shí)果形的變化，這一研究與張大海等[13]研究結(jié)果一致。任瑩瑩等[14]認(rèn)為，在初花期至花后兩周，尤其是盛花期，噴施NAA、PBO和乙烯利可影響庫爾勒香梨萼片宿存，其中噴施PBO可提高90%以上的脫萼率。由前人研究得知，使用PBO、ETH、NAA處理可增加庫爾勒香梨萼片的脫落[15]，用GA處理可減少庫爾勒香梨萼片的脫落[2]。使用ABA、ETH和NAA三種激素處理使得庫爾勒香梨梨花kfpSPL基因的表達(dá)量上調(diào)，而用PBO和GA處理后kfpSPL基因表達(dá)量受處理時(shí)間和樹勢強(qiáng)弱的影響。kfpSPL基因很可能與庫爾勒香梨萼片脫落與宿存的激素調(diào)控有一定的關(guān)系。

4 結(jié) 論

kfpSPL基因啟動(dòng)子序列中存在與赤霉素、脫落酸、水楊酸等激素相關(guān)的順式作用元件，不同生長調(diào)節(jié)劑處理脫萼果和宿萼果的花器官可以調(diào)控kfpSPL基因的表達(dá)水平。在kfpSPL基因的啟動(dòng)子序列中可能含有對其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中起到重要作用的順式調(diào)控作用元件，如脫落酸響應(yīng)式順式調(diào)控作用元件ABRE，赤霉素響應(yīng)順式作用調(diào)控元件GARE-motif和P-box，水楊酸響應(yīng)順式作用調(diào)控元件TCA-element，而這三種激素處理可能影響庫爾勒香梨萼片的脫落和宿存。