何 偉，許建軍，楊 華，孫曉軍

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】列當(dāng)是一類寄生在植物根部寄生生活的列當(dāng)科(Orobanchaceae) 列當(dāng)屬(OrobancheL.) 植物的總稱。列當(dāng)寄主范圍非常廣泛，可寄生在豆科、十字花科、葫蘆科、亞麻科、茄科、菊 科、禾本科和大麻科等植物根上[1]。近年來新疆加工番茄受到列當(dāng)嚴(yán)重危害，造成大量減產(chǎn)，遭受列當(dāng)危害加工番茄減產(chǎn)30%～80%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)。列當(dāng)已成為制約新疆加工番茄生產(chǎn)主要因素之一。篩選適宜本地自然環(huán)境的強(qiáng)致病性菌株可為列當(dāng)生防菌提供菌株資源。研究將從新疆加工番茄田間自然發(fā)病列當(dāng)上分離獲得致病性強(qiáng)的菌株，為新疆加工番茄列當(dāng)生防菌提供菌種資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用致病菌防除列當(dāng)多為鐮刀菌。如Thomas 等[2]報(bào)道的尖孢鐮刀菌[F.oxysporumf. sp.orthoceras(Appel & Wollenw.) Bilay]和Nemat Alla 等[3]報(bào)道尖孢鐮刀菌(F.oxysporumSchl.) Foxy I和Foxy II的孢子懸浮液分別對向日葵列當(dāng)、鋸齒列當(dāng)和分枝列當(dāng)具有一定防治效果。而其他鐮刀菌包括彎角鐮刀菌(F.camptocerasWollenw.&Reink.)、厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporumWollenw. & Reinking)[4]和輪狀鐮刀菌(F.verticillioidesNirenb.)[5]等也均具有防除列當(dāng)?shù)臐撃堋３牭毒?，熒光假單胞?PseudomonasfluorescensFlügge)[6]、UlocladiumbotrytissPreuss.[7]和洋蔥曲霉[8]也具有類似的防除作用。國內(nèi)研究者也從發(fā)病列當(dāng)植株上分離獲得多種鐮刀菌菌株，如王之樾等[9]從新疆瓜列當(dāng)獲得一個(gè)鐮刀菌并試制成“生防劑F798；孔令曉等[10]從向日葵列當(dāng)上分離獲得的鐮刀菌L2菌株；丁麗麗等[11]從新疆瓜列當(dāng)上分離的菌株中篩選出4個(gè)對列當(dāng)高致病性菌株；柴阿麗等[12]從新疆加工番茄田采集列當(dāng)病樣分離獲得銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】采用生防菌防治列當(dāng)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)，研究篩選對加工番茄列當(dāng)具有強(qiáng)致病力的菌株?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究采集新疆加工番茄田間自然發(fā)病列當(dāng)，組織分離獲得菌株，菌株發(fā)酵液和粗毒素提取液抑制列當(dāng)種子萌芽及活體接種，篩選致病性強(qiáng)的菌株，采用形態(tài)學(xué)特征并輔以分子生物學(xué)方法鑒定。為加工番茄列當(dāng)生防菌的開發(fā)應(yīng)用提供菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣本：2016年加工番茄坐果期，在呼圖壁縣、昌吉市、吉木薩爾縣、和碩縣、焉耆縣和博湖縣等加工番茄田間采集自然發(fā)病列當(dāng)植株。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與純化

使用消毒剪刀將列當(dāng)病健交界處剪成3～5 mm的小塊，將小塊在70%酒精中消毒1 min，轉(zhuǎn)移至3%次氯酸鈉溶液中消毒5 min，轉(zhuǎn)至PDA平板上。培養(yǎng)2～3 d后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上。菌落長成后挑單孢進(jìn)行純化，并試管保存菌株。

1.2.2 菌株發(fā)酵液和粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽抑制作用測定

(1)列當(dāng)種子預(yù)處理

將列當(dāng)種子在70%酒精消毒1.5 min后轉(zhuǎn)移至1%次氯酸鈉消毒12 min，晾干使用。

(2)菌株發(fā)酵液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果測定

將列當(dāng)致病菌接入PDA培養(yǎng)培養(yǎng)基中，7 d后打孔4～5個(gè)轉(zhuǎn)入100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)7 d，26℃，160 r/min。將一張whatman濾紙(GA/A)置于培養(yǎng)皿中，用無菌水浸濕，將20粒列當(dāng)種子置于濾紙上，每處理4次重復(fù)。在每個(gè)培養(yǎng)皿中依次加入5 mL GR24和5 mL發(fā)酵液，對照處理是5 mL GR24和5 mL滅菌水。在室溫25℃，遮光條件下培養(yǎng)7～10 d后，體式顯微鏡下觀察列當(dāng)種子萌芽數(shù)量并記錄。

(3)菌株粗毒素的提取

將列當(dāng)致病菌轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基中，待菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)基，采用直徑0.6 cm打孔器打孔。用灼燒過的接種針挑取4～5片接種于裝有250 mL PDB液體培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，每個(gè)菌株接種兩瓶。置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)7 d(26℃，160 r/min)后取培養(yǎng)液15 mL離心10 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，取上清液，高壓滅菌后得到粗毒素提取液。

(4)菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果測定

將20粒列當(dāng)種子中置于Whatman玻璃濾紙(GA/A)，加入5 mL GR24和5 mL菌株粗毒素提取液，每個(gè)菌株3次重復(fù)，空白對照為5 mL GR24和5 mL滅菌水。在室溫25℃，遮光條件下培養(yǎng)7～10 d后，體式顯微鏡下觀察列當(dāng)種子萌芽數(shù)量并記錄。將抑制列當(dāng)種子萌芽抑制效果高的菌株粗毒素提取液稀釋500和1 000倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，方法同上。

1.2.3 盆栽試驗(yàn)

(1)菌株致病性測定

盆栽試驗(yàn)采取以下三種方式進(jìn)行接種，接種菌株孢子懸浮液濃度在106～107個(gè)孢子/mL(每200 mL中滴兩滴Tween20)。

針刺法：每株列當(dāng)分三段，莖基部、莖中部、莖頂端，用無菌牙簽沾取菌液(無菌水稀釋過的)，針刺列當(dāng)植株，傷口用濕潤的脫脂棉覆蓋保濕24 h后摘下。

涂抹法：每株列當(dāng)分三段，莖基部、莖中部、莖頂端，用無菌牙簽挑取菌絲，涂抹列當(dāng)植株，涂抹的地方用濕潤的脫脂棉覆蓋保濕24 h后摘下。

噴霧法：用無菌水稀釋過的菌液倒入噴壺中，噴灑剛出土的列當(dāng)，最后整株列當(dāng)用地膜覆蓋保濕24 h后摘下?？瞻讓φ諡榍逅幚怼＝臃N3 d后觀察列當(dāng)病情并記錄。

(2)菌株孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制作用測定

選擇對列當(dāng)植株致病性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行孢子懸浮液對盆栽列當(dāng)防治效果實(shí)驗(yàn)，將土壤高溫消毒后裝盆，每盆裝約3.2 kg，將50 mg列當(dāng)種子與土混勻后撒播與番茄苗根部。將30 d苗齡的番茄苗移入盆中，每盆一株苗，每盆澆灌200 mL菌懸液，每菌株4次重復(fù)，空白對照澆灌清水。孢子懸浮液濃度在106～107個(gè)孢子/mL。15 d后調(diào)查列當(dāng)出土數(shù)量并計(jì)算抑制效果。

1.2.4 菌株鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定

將從列當(dāng)致病植株上分離得到的菌株接種于PSA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)和產(chǎn)生色素情況。在PSA上25℃培養(yǎng)4 d后測量菌落生長直徑。大型和小型分生孢子形態(tài)、厚垣孢子形態(tài)以及分生孢子梗形態(tài)培養(yǎng)11 d后觀察大型孢子分生孢子大小、形態(tài)、分隔數(shù)以及小型分生孢子的大小、形態(tài)，并觀察厚垣孢子的形態(tài)和大小以及分生孢子梗形態(tài)。

(2)分子生物學(xué)鑒定

采用真菌DNA試劑盒提取菌株DNA基因組，引物為真菌通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC，真菌DNA提取試劑盒與引物合成均為北京鼎國昌盛生物科技有限公司。反應(yīng)體系為50 μL，其中2XMix 25 μL、ITS1 (10 μM) 1 μL、ITS4 (10 μM)1 μL、DNA模板2 μL，ddH2O加至50 μL。反應(yīng)條件，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，72℃延伸10 min，35cycles。PCR產(chǎn)物回收，2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷，加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1 g，60℃水浴至膠完全溶化，加入50 μL回收試劑溶液B，混勻 ，將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/m，1 min，棄液體，加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/m，離心1 min，棄液體，重復(fù)一次，12 000 r/m，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min，將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min，13 000 r/m，離心3 min，管底即為純化產(chǎn)物。純化產(chǎn)物在北京鼎國昌盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。以NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast程序比對分析，采用MEGA6.0軟件中鄰接法進(jìn)行聚類分析鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 列當(dāng)致病菌的分離與純化

加工番茄田間采集自然發(fā)病寄生性雜草列當(dāng)106株典型病樣，帶回實(shí)驗(yàn)室采用常規(guī)組織分離，共計(jì)獲得60個(gè)菌株。

2.2 分離菌株發(fā)酵液對列當(dāng)種子萌發(fā)抑制作用

研究表明，菌株發(fā)酵液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果最好的菌株為2016-22和2016-51，抑制效果均為100%，其次是菌株2016-26、2016-44、2017-6，抑制效果分別為92.86%、90.48%、92.86%。表1

表1 不同菌株發(fā)酵液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果比較

Table 1 Comparison of inhibition effect of different strains fermented liquid to broomrape seed germination

菌株編號Strain number萌發(fā)率(%)Germination rate抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect2016-150.0050.0028.57a2016-516.6783.3376.192016-836.6763.3347.62bc2016-1025.0075.0064.29de2016-1335.0065.0050.00c2016-1435.0065.0050.00c2016-1721.6778.3369.05ef2016-220100100i2016-265.0095.0092.86hi2016-2730.0070.0057.14cd2016-2813.3386.6780.95g2016-2911.6788.3383.33g2016-3618.3381.6773.81fg2016-3710.0090.0085.71gh2016-4213.3386.6780.95g2016-4336.6763.3347.62bc2016-446.6793.3390.48h2016-4618.3381.6773.81fg2016-4915.0085.0078.57g2016-510100.00100i2016-5525.0075.0064.29de2017-65.0095.0092.86hiCK70.0030.00

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.3 菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽抑制作用

研究表明，2016-14、2016-27、2016-28、2016-36、2016-37、2016-42、2016-46等8個(gè)菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子的萌發(fā)抑制效果達(dá)到100%。2016-17、2016-22、2016-44、2016-51、2016-55、2017-6等6個(gè)菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子的萌芽抑制效果均在90%以上，分別為95.24%、96.83%、96.83%、95.24%、92.06%、92.06%。在500倍粗毒素提取液濃度下，2016-14、2016-27、2016-42、2016-46等4個(gè)菌株粗毒素提取液對列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)抑制效果均在40%以上，分別為40.48%、45.24%、59.52%、42.86%。在1 000倍粗毒素濃度下，2016-27、2016-42、2016-46、2016-51等4個(gè)菌株粗毒素提取液對列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)抑制效果分別為2.38%、7.14%、4.76%、2.38%，其余菌株對列當(dāng)種子無抑制效果。表2

表2 不同菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果比較

Table 2 Comparison inhibition effect of different strains of crude toxin extract to broomrape seed germination

菌株母液 Mother liquor500倍 500 times1 000倍 1,000 times抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect抑制率(%)Inhibition rate抑制效果(%)Inhibition effect2016-193.3389.47bc2016-591.6786.84b2016-891.6786.84b2016-1085.0076.32a2016-1388.3381.58ab2016-14100100d58.3340.48gh30.0002016-1796.6794.74c48.3326.19e30.0002016-2298.3397.37cd53.3333.33ef30.0002016-2691.6786.84b2016-27100100d61.6745.24h31.672.382016-28100100d41.6716.67d30.0002016-2988.3381.58ab2016-36100100d36.679.52c30.0002016-37100100d51.6730.95ef30.0002016-42100100d71.6759.52i35.007.142016-4386.6778.95a2016-4498.3397.37cd30.000a30.0002016-46100100d60.0042.86h33.334.762016-4988.3381.58ab2016-5196.6794.74c55.0035.71fg31.672.382016-5595.0092.11c35.007.14bc30.0002017-695.0092.11c33.334.76b30.000CK36.6730.0030.00

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.4 不同接種方式菌株對列當(dāng)致病性

研究表明，供試的7個(gè)菌株針刺法都可引起列當(dāng)明顯發(fā)病。其中菌株2016-14、2016-36接種3 d后即發(fā)病并迅速引起萎蔫、腐爛和莖基部褐變，接種7 d后整株腐爛，死亡。在涂抹法中，菌株2016-36、2016-42和2017-6對列當(dāng)?shù)那秩拘宰顝?qiáng)，接種3 d表現(xiàn)明顯發(fā)病，接種7 d后整株腐爛，死亡。在噴灑霧中，菌株2016-42和2017-6的致病效果最好，接種3 d后發(fā)病，7 d后整株腐爛，死亡。采用針刺、涂抹和噴霧等3種接種方式進(jìn)行接種，不同菌株在不同接種方式下，發(fā)病情況具有明顯差異。表3，圖1

表3 不同接種方式菌株致病性比較

Table 3 Comparison of pathogenic of strains by different ways of inoculation

菌株編號Strain number針刺接種Acupuncture inoculation涂抹接種Daub inoculation噴霧接種Spray inoculation2016-14傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡莖基部變褐無癥狀2016-27傷口及周圍變褐傷口及周圍變褐無癥狀2016-28傷口及周圍變褐,整株萎蔫傷口及周圍變褐無癥狀2016-29傷口變褐無癥狀無癥狀2016-36傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡輕微褐變2016-42傷口及周圍變褐莖基部變褐,整株變腐死亡莖基部變褐,整株變腐死亡2017-6傷口變褐,整株萎蔫,變腐死亡整株萎蔫死亡整株萎蔫死亡

A：針刺接種；B：噴霧接種；C：涂抹接種；D空白對照

A：Acupuncture inoculation；B：Spray inoculation；C：Daub inoculation；D：CK

圖1 菌株2016-42不同接種方式下列當(dāng)發(fā)病情況

Fig.1 The infection situation of Broomrape use different inoculation by Strain 2016-42

2.5 菌株孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制作用

研究表明，供試的3個(gè)菌株中，菌株2016-36和2016-42孢子懸浮液處理列當(dāng)出土?xí)r間最早，較空白對照提前10 d，菌株2017-6孢子懸浮液列當(dāng)出土?xí)r間最晚，較空白對照延遲22 d。3個(gè)菌株孢子懸浮液處理列當(dāng)出土抑制效果具有顯著差異，菌株2017-6孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制效果最好，抑制效果為94.65%，其次是菌株2016-42，抑制效果為25.05%，菌株2016-36最低，抑制效果為19.70%。表4

表4 不同菌株孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制效果比較

Table 4 Comparison of broomrape inhibition effect of different strains spore suspension

菌株Strains平均單盆列當(dāng)出土數(shù)量 The number average single basin unearthed broomrape (strain/pot)9月25日10月6日10月18日10月28日總計(jì) Sum抑制效果(%)Inhibition effect2017-60000.250.2594.65b2016-361.2502.503.7519.70a2016-4211.251.2503.525.05aCK01.672.670.334.67

注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05

Note：The different small letters represent significant difference at 5% level

2.6 菌株鑒定

2.6.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

菌株2017-6培養(yǎng)性狀：在 PSA上25℃、4 d的菌落直徑為3.0～4.5 cm。氣生菌絲白色，羊毛狀。形態(tài)特征：小型分生孢子數(shù)目多，橢圓形，腎形，0～1隔，大小(6.65～17.48) μm×(2.49～4.51) μm。大型分生孢紡錘形或鐮刀形，基胞足跟明顯，2～6分隔，多為2～3分隔，大小(3.50～4.51) μm×(17.41～39.46) μm。分生孢子梗長，單瓶梗，厚垣孢子頂生或串生。根據(jù)上述培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參考王拱辰等的《常見鐮刀菌鑒定指南》[13]，將菌株2017-6鑒定為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。

2.6.2 菌株18S rDNA的ITS序列分析

通過GenBank中進(jìn)行Blast比對，應(yīng)用MEGA6.0軟件中鄰接法構(gòu)建聚類分析樹狀圖，bootstrap檢驗(yàn)值≥50%，1 000次重復(fù)?；跀?shù)據(jù)庫中18個(gè)菌株的ITS序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確證菌株2017-6的分類歸屬。菌株2017-6與菌株KF751873.1Fusariumoxysporum在同一分支上，且兩個(gè)菌株ITS序列相似性為99%，這與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。圖2

圖2 菌株2017-6的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

Fig.2 The phylogenetic tree of strain 2017-6

3 討 論

目前提出的防除列當(dāng)?shù)拇胧┲饕ㄈ斯ぐ纬?、化學(xué)防除、農(nóng)藝措施、培育抗性品種和昆蟲防除等[14]，但上述措施生產(chǎn)上應(yīng)用存在缺陷，很難有效控制列當(dāng)為害，因此,篩選對列當(dāng)致病使其自然死亡的致病菌作為生防因子已成為研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外已有很多關(guān)于從微生物防除列當(dāng)?shù)膱?bào)道，主要有鐮刀菌(Fusariumspp.)[15]、根瘤菌[16]、叢枝菌根真菌[17]和假單胞桿菌[18]等。已報(bào)道的從列當(dāng)植株上分離獲得的致病菌多為鐮刀菌。研究中篩選出的菌株為鐮刀菌，但由于鐮刀菌中的許多種為多種植物病害的致病菌，因此，此類病原菌在使列當(dāng)致病的同時(shí)也可能對寄主或其他農(nóng)作物造成危害。要開發(fā)出對加工番茄安全且對列當(dāng)高度致病的生防菌劑，還需要對已篩選菌株的寄主范圍、安全使用濃度以及使用方法等做進(jìn)一步的研究。

列當(dāng)種子萌芽至寄生在寄主根部階段是防治列當(dāng)最佳時(shí)期[19]。研究中鐮刀菌菌株發(fā)酵液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果較菌株粗毒素提取液差，菌株粗毒素提取液隨著稀釋倍數(shù)增加對列當(dāng)種子萌芽抑制效果降低，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1 000倍時(shí)，菌株粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽無抑制效果。采用濃縮或添加助劑提高菌株毒素對列當(dāng)種子萌芽抑制效果可作為進(jìn)一步研究方向。

土壤中存在多種對植物土傳病害有防治作用的有益微生物，而寄主植物對列當(dāng)?shù)目剐詸C(jī)理與植物對病原菌的抗性機(jī)理十分類似，因此,有益土壤微生物可能也可以防除列當(dāng)[14]。此外，與從列當(dāng)植株上分離的微生物相比，分離自土壤中微生物易在土壤中存活繁殖，且能夠在列當(dāng)種子萌芽和侵染寄主時(shí)發(fā)揮作用，因此，從該地加工番茄田間發(fā)病列當(dāng)植株根際土壤中分離防除列當(dāng)微生物可作為篩選列當(dāng)生防菌的一個(gè)研究方向。

國內(nèi)研究者從不同區(qū)域多種列當(dāng)上分離獲得對列當(dāng)植株致病性強(qiáng)的菌株[10-13]，但未見菌株孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制效果的報(bào)道。研究篩選的菌株對列當(dāng)出土具有較好抑制效果，但其作用機(jī)理、土壤中定殖能力及其與土壤中微生物群落相互作用需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

篩選出的菌株2017-6粗毒素提取液對列當(dāng)種子萌芽抑制效果在90%以上，其孢子懸浮液對列當(dāng)植株具有強(qiáng)致病性。目前，多數(shù)列當(dāng)生防菌均是在列當(dāng)出土后進(jìn)行防治，此時(shí)作物已經(jīng)遭受危害，且由于列當(dāng)出土多在作物生育中后期，不易被發(fā)現(xiàn)，防治較為困難。菌株2017-6孢子懸浮液對列當(dāng)出土抑制效果達(dá)94.65%，且可有效延緩列當(dāng)出土?xí)r間。