劉 彧， 王 琳， 楊伊如， 何 淼， 周蘊(yùn)薇

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

露地菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)具有植株低矮、花期長、花色豐富、抗性強(qiáng)及管理粗放等特點(diǎn)，是華北和東北地區(qū)園林綠化建設(shè)中重要的地被植物材料[1]。干旱對露地菊的生長和觀賞價值有嚴(yán)重影響，因此，提高露地菊的適應(yīng)性，拓寬其應(yīng)用區(qū)域，尤其在土壤瘠薄和干旱地區(qū)的綠化具有重要意義。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是一類家族龐大且廣泛存在的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，是具有多種生物功能的調(diào)控蛋白。NAC基因家族編碼的蛋白質(zhì)在N端均含有一段約150個氨基酸組成的保守區(qū)域，C端是轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，具有促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄活性的功能[2-3]。已有研究結(jié)果表明：一些NAC轉(zhuǎn)錄因子可以被至少1種非生物脅迫誘導(dǎo)并應(yīng)答[4]。從黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn.)中克隆的AaNAC1基因可能是應(yīng)激信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，當(dāng)AaNAC1基因在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中過表達(dá)時，轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)，并且對灰葡萄孢的抗性增強(qiáng)[5]；過表達(dá)TaNAC2基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥對NaCl脅迫和干旱脅迫的抗性均有所提高[6]；過表達(dá)PtrNAC72基因的轉(zhuǎn)基因煙草(NicotianatabacumLinn.)也表現(xiàn)出對干旱脅迫耐受性增強(qiáng)的特征[7]。但目前尚未見有關(guān)轉(zhuǎn)NAC基因露地菊抗旱性方面的評價研究。

植物中能量的轉(zhuǎn)化和合成主要通過光合作用來完成，植株的生長情況與光合速率有直接關(guān)聯(lián)。一方面，光合速率影響植物的能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)累積；另一方面，植物的生長情況，如生長環(huán)境是否適宜，是否受生物及非生物脅迫，也會在光合指標(biāo)中得到體現(xiàn)。葉綠素?zé)晒馀c光合作用關(guān)系密切，以葉綠素為探針，可以快速并更加敏感地探測植物的光合功能情況[8]、生長和生理狀況以及生物脅迫對植株內(nèi)在的影響[9-10]。水分變化對光合作用的影響十分明顯，水分缺失情況下植物光合效率低，不能及時消耗吸收的光能，從而損傷光合器官，致使光合電子傳遞鏈和PSⅡ反應(yīng)中心被破壞[11-13]。

作者所在課題組的前期研究中將ClNAC9基因轉(zhuǎn)入露地菊品種‘紐9717’(‘Niu 9717’)[14]，本研究對露地菊品種‘紐9717’的野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系進(jìn)行干旱脅迫處理，并對不同干旱脅迫時間葉片的葉綠素含量以及光合和葉綠素?zé)晒馓匦赃M(jìn)行比較，研究ClNAC9基因的轉(zhuǎn)入對露地菊品種‘紐9717’抗旱性的影響，以期為擴(kuò)大露地菊的園林應(yīng)用范圍提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存的露地菊品種‘紐9717’的野生型(WT)和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系(ClNAC9-5、ClNAC9-6和ClNAC9-13株系)的組培苗。待組培苗根長約1.5 cm時，移至裝有草炭土和蛭石(體積比1∶1)的混合培養(yǎng)基質(zhì)中。人工氣候培養(yǎng)室溫度21 ℃～25 ℃，空氣相對濕度30%～40%。經(jīng)過6周培養(yǎng)，植株長出6～7對真葉后，將培養(yǎng)基質(zhì)澆至水分飽和，然后采取自然失水的方法對野生型以及ClNAC9-5、ClNAC9-6和ClNAC9-13株系進(jìn)行干旱脅迫處理，其中，野生型為對照。對干旱脅迫0、5、10和15 d 4種材料植株的形態(tài)進(jìn)行拍照，同時進(jìn)行取樣，然后對葉片的葉綠素含量以及光合和葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 每種材料隨機(jī)選取3株，每株選擇植株中部生長良好且無病蟲害的葉片5枚，用鋁箔包好，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存。葉片中葉綠素含量參考Wang等[15]的方法進(jìn)行測定。重復(fù)測定3次。

1.2.2 光合參數(shù)的測定 于晴朗無云日的上午9：00—11：00，每種材料隨機(jī)選取3株，每株選擇植株中上部生長良好且無病蟲害的功能葉1枚并標(biāo)記，分別于干旱脅迫0、5、10和15 d使用LI-6400XT便攜式光合儀(美國LI-COR公司)測定各植株葉片在光照強(qiáng)度1 200 μmol·m-2·s-1下的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和水分利用效率(WUE)。每次測定重復(fù)讀數(shù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 于晴朗無云日的上午9：00—11：00，每種材料隨機(jī)選取3株，每株選擇植株中上部生長良好且無病蟲害的功能葉1枚并標(biāo)記，分別于干旱脅迫0、5、10和15 d后暗處理約12 h，使用LI-6400XT便攜式光合儀，加載熒光LCF配置系統(tǒng)，采用葉室熒光測定各植株葉片的初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、可變熒光(Fv)、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)。每次測定重復(fù)讀數(shù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用EXCEL 2007和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 干旱脅迫下轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片中葉綠素含量的比較

不同干旱脅迫時間轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片中葉綠素含量見表1。由表1可見：干旱脅迫0、5、10和15 d，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量高于或顯著(P<0.05)高于野生型。干旱脅迫0～15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量總體上呈先升高后降低的變化趨勢，其中，野生型葉片中葉綠素含量于干旱脅迫5 d達(dá)到峰值，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量均于干旱脅迫10 d達(dá)到峰值。干旱脅迫0 d，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量顯著高于野生型；干旱脅迫5 d，野生型以及ClNAC9-6和ClNAC9-13株系葉片中葉綠素含量較干旱脅迫0 d有所升高，而ClNAC9-5株系葉片中葉綠素含量略有降低；干旱脅迫10 d，野生型葉片中葉綠素含量較干旱脅迫5 d降低，而3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量略有升高；干旱脅迫15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量均較干旱脅迫10 d明顯降低，且3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片中葉綠素含量顯著高于野生型。

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.2 干旱脅迫下轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片光合參數(shù)的比較

不同干旱脅迫時間轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片的光合參數(shù)見表2。由表2可見：干旱脅迫0～15 d，野生型葉片凈光合速率(Pn)持續(xù)降低，而3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Pn值均呈先升高后降低的變化趨勢，且均于干旱脅迫5 d達(dá)到最高值。干旱脅迫15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Pn值均降到最低，其中，野生型葉片Pn值顯著(P<0.05)低于3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系?？傮w上看，不同干旱脅迫時間ClNAC9-5株系葉片Pn值最高，野生型葉片Pn值最低，二者間差異達(dá)到顯著水平。

由表2還可見：干旱脅迫0～15 d，野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)呈先升高后降低的變化趨勢，ClNAC9-6株系葉片Gs值呈逐漸降低的變化趨勢。干旱脅迫0 d，ClNAC9-6株系葉片Gs值顯著高于野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系；干旱脅迫5 d，ClNAC9-6株系葉片Gs值較干旱脅迫0 d降低，而野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系葉片Gs值略有升高；干旱脅迫10和15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Gs值均不同程度降低，其中，野生型葉片Gs值的降幅最大，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Gs值顯著高于野生型。

由表2還可見：干旱脅迫0～15 d，野生型和ClNAC9-13株系葉片蒸騰速率(Tr)呈逐漸降低的變化趨勢，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片Tr值呈波動降低的變化趨勢。干旱脅迫0 d，ClNAC9-13株系葉片Tr值最低，ClNAC9-6株系葉片Tr值最高，二者間差異顯著；干旱脅迫5 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Tr值較干旱脅迫0 d不同程度降低；干旱脅迫10 d，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片Tr值較干旱脅迫5 d略有回升，而野生型和ClNAC9-13株系葉片Tr值繼續(xù)降低；干旱脅迫15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Tr值較干旱脅迫10 d明顯降低，其中，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Tr值顯著高于野生型。

由表2還可見：干旱脅迫0～15 d，野生型葉片水分利用效率(WUE)呈逐漸降低的變化趨勢，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片WUE值呈先升高后降低的變化趨勢。干旱脅迫0 d，ClNAC9-13株系葉片WUE值最高，ClNAC9-6株系葉片WUE值最低，二者間差異顯著；干旱脅迫5 d，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片WUE值較干旱脅迫0 d明顯升高，ClNAC9-13株系葉片WUE值略有升高，野生型葉片WUE值略有降低；干旱脅迫10 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片WUE值較干旱脅迫5 d不同程度降低，其中，ClNAC9-5株系的降幅最大；干旱脅迫15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片WUE值繼續(xù)降低，其中，野生型葉片WUE值最低。

3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Pn、Gs、Tr和WUE值的降幅均小于野生型?？傮w上看，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片的Pn、Gs和Tr值顯著高于野生型和ClNAC9-13株系，且ClNAC9-5株系葉片的WUE值較高。

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.3 干旱脅迫下轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的比較

2.3.1 葉片初始熒光(Fo)、最大熒光(Fm)和可變熒光(Fv)的比較 不同干旱脅迫時間轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片F(xiàn)o、Fm和Fv值見表3。由表3可見：干旱脅迫0～15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)o值均呈先降低后升高的變化趨勢；野生型和ClNAC9-13株系葉片F(xiàn)m和Fv值呈逐漸降低的變化趨勢，ClNAC9-5株系葉片F(xiàn)m和Fv值基本呈先降低后升高的變化趨勢，ClNAC9-6株系葉片F(xiàn)m和Fv值呈“降低—升高—降低”的變化趨勢。干旱脅迫15 d，野生型葉片F(xiàn)o值顯著(P<0.05)高于3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系，而其葉片F(xiàn)m和Fv值顯著低于3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系。在整個干旱脅迫過程中，ClNAC9-6株系葉片F(xiàn)m和Fv值總體上顯著高于野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系；其葉片F(xiàn)o值在干旱脅迫0～15 d總體上顯著高于ClNAC9-5株系，而其葉片F(xiàn)o值僅在干旱脅迫初期高于野生型和ClNAC9-13株系，在干旱脅迫后期明顯低于野生型和ClNAC9-13株系。

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

2.3.2 葉片PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和PSⅡ潛在光化學(xué)活性(Fv/Fo)的比較 不同干旱脅迫時間轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值見表4。由表4可見：干旱脅迫0～15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值均呈先升高后降低的變化趨勢。干旱脅迫0 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)v/Fm值在0.79左右，F(xiàn)v/Fo值在3.9左右；干旱脅迫5 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值較干旱脅迫0 d略有升高；干旱脅迫10 d，野生型和ClNAC9-13株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值較干旱脅迫5 d降低，而ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值繼續(xù)升高；干旱脅迫15 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值均較干旱脅迫10 d降低。總體上看，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo值的降幅小于野生型。

2.3.3 葉片光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)的比較 不同干旱脅迫時間轉(zhuǎn)ClNAC9基因露地菊品種‘紐9717’葉片qP和qN值見表5。由表5可見：干旱脅迫0～15 d，野生型葉片qP值呈逐漸降低的變化趨勢，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值呈先降低后升高的變化趨勢。干旱脅迫0 d，ClNAC9-6株系葉片qP值較高，ClNAC9-5株系葉片qP值較低，野生型和ClNAC9-13株系葉片qP值居中；干旱脅迫5 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值較干旱脅迫0 d不同程度降低，其中，ClNAC9-13株系的降幅較大；干旱脅迫10 d時，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值繼續(xù)降低，其中，野生型的降幅最大；干旱脅迫15 d，野生型葉片qP值繼續(xù)降低，而3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值有所升高， 3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值顯著高于野生型。

由表5還可見：干旱脅迫0～15 d，野生型葉片qN值呈先降低后升高的變化趨勢，ClNAC9-5和ClNAC9-13株系葉片qN值呈逐漸升高的變化趨勢，ClNAC9-6株系葉片qN值呈先升高后降低的變化趨勢。干旱脅迫0 d，ClNAC9-6和ClNAC9-13株系葉片qN值較高；干旱脅迫5 d，野生型葉片qN值較干旱脅迫0 d略有降低，而3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qN值略有升高；干旱脅迫10 d，野生型和3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qN值較干旱脅迫5 d不同程度升高，其中，ClNAC9-6株系的升幅最大；干旱脅迫15 d，野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系葉片qN值較干旱脅迫10 d明顯升高，而ClNAC9-6株系葉片qN值略有降低，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qN值顯著高于野生型。

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant difference (P<0.05).

2)WT： 野生型Wild type； ClNAC9-5，ClNAC9-6，ClNAC9-13： 轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系Transgenic lines withClNAC9 gene.

3 討 論

干旱脅迫影響植物的光合色素、光系統(tǒng)、電子傳遞系統(tǒng)以及CO2還原途徑等，降低植物的整體光合能力[16]。植物具有一系列調(diào)控機(jī)制以增強(qiáng)對干旱脅迫的耐受性，主要包括增加擴(kuò)散阻力、減少水分喪失、擴(kuò)大根系吸收水分范圍和效率以及降低葉片蒸騰損失[17]。干旱脅迫過程中，氣孔導(dǎo)度(Gs)隨葉片水勢發(fā)生變化，一定程度上限制CO2進(jìn)入葉片，并降低蒸騰作用，提高水分利用效率(WUE)，進(jìn)而影響凈光合速率(Pn)。已有研究結(jié)果表明：當(dāng)植株受到干旱脅迫時，葉片的葉綠素含量、Gs值、Pn值、蒸騰速率(Tr)和干質(zhì)量不同程度降低[18-19]，其中，葉綠素含量的降低導(dǎo)致葉片對光能的吸收能力下降，光能損失嚴(yán)重[20]。Tamirisa等[21]的研究結(jié)果表明：脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較高的光合速率。本研究結(jié)果顯示：干旱脅迫過程中，露地菊品種‘紐9717’的野生型以及ClNAC9-5和ClNAC9-13株系葉片Gs值呈先略有升高后逐漸降低的變化趨勢，ClNAC9-6株系葉片Gs值呈逐漸降低的變化趨勢，表明植株受到干旱脅迫時對氣孔進(jìn)行了有效調(diào)節(jié)，減少葉片水分散失；ClNAC9-5和ClNAC9-6株系葉片Tr值呈波動降低的變化趨勢，野生型和ClNAC9-13株系葉片Tr值持續(xù)降低，其中野生型的降幅最大；野生型葉片Pn值持續(xù)降低，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片Pn值均先升高后降低，說明轉(zhuǎn)基因植株在單位時間內(nèi)同化有機(jī)物的能力更強(qiáng)；野生型葉片WUE值也持續(xù)降低，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片WUE值呈先升高后降低的變化趨勢，其中，ClNAC9-6株系葉片WUE值的變化幅度較小，說明干旱脅迫下轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片的保水能力和氣體交換能力更強(qiáng)，在水分缺失時能夠更有效地調(diào)控植株的光合能力。

光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)表示PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度，且直接體現(xiàn)捕獲光子能量用于光化學(xué)反應(yīng)能力。野生型葉片qP值在整個干旱脅迫過程中持續(xù)降低，表明PSⅡ反應(yīng)中心大幅度關(guān)閉，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qP值在干旱脅迫0～10 d持續(xù)降低后在干旱脅迫15 d升高，說明轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系在干旱脅迫15 d有效調(diào)控了能量傳遞[26]。非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)升高，表明葉片以熱耗散的方式消耗過剩激發(fā)能，從而保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免遭光破壞[27]。Zhou等[28]認(rèn)為，干旱脅迫下番茄(LycopersiconesculentumMill.)葉片qN值降低。Mathobo等[29]研究認(rèn)為，干旱脅迫下菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)葉片qP和qN值總體上呈升高的趨勢。本研究中，野生型葉片qN值呈先降低后升高的變化趨勢，3個轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系葉片qN值總體上呈升高的變化趨勢，表明在干旱脅迫過程中轉(zhuǎn)ClNAC9基因株系能通過熱耗散的方式來保護(hù)光合器官的能力較佳。

綜合研究結(jié)果顯示：干旱脅迫下轉(zhuǎn)ClNAC9基因使露地菊品種‘紐9717’葉片的Pn和WUE值升高，PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度和最大光化學(xué)效率增大，PSⅡ反應(yīng)中心的受損程度減小，光系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)制增強(qiáng)，從而增強(qiáng)了露地菊的抗旱性。其中，ClNAC9-5和ClNAC9-6株系對干旱脅迫的耐受性較強(qiáng)，ClNAC9-13株系對干旱脅迫的耐受性較弱，但均強(qiáng)于野生型。