張志濤 張紅艷 牛芳芳

[摘要] 目的 探討高糖狀態(tài)對前列腺癌細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。 方法 人前列腺癌細胞株LNCap經(jīng)過不同葡萄糖濃度處理后，采用DCFH-DA熒光探針檢測LNCap細胞活性氧（ROS）水平，采用過氧化氫（H2O2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）試劑盒檢測LNCap細胞中H2O2水平以及各抗氧化酶活性；采用Western blot檢測LNCap細胞中SOD1和SOD2蛋白表達水平；LNCap細胞轉(zhuǎn)染si-SOD2后檢測H2O2水平。 結(jié)果 LNCap細胞內(nèi)ROS和H2O2水平隨葡萄糖濃度升高而升高，且呈濃度依賴性（P < 0.05）；LNCap細胞內(nèi)T-SOD、CAT活性在高糖環(huán)境中明顯增強（P < 0.05），而GPX活性無明顯變化（P > 0.05）；在高糖環(huán)境中，LNCap細胞內(nèi)SOD2表達水平明顯升高（P < 0.05），而SOD1表達水平無明顯變化（P > 0.05）；SOD2基因沉默后，高糖環(huán)境下LNCap細胞內(nèi)H2O2水平明顯降低（P < 0.05）。 結(jié)論 高糖狀態(tài)對前列腺癌細胞氧化應(yīng)激水平具有促進作用，H2O2水平的升高可能受SOD2表達的調(diào)控。

[關(guān)鍵詞] 高糖；前列腺癌細胞；活性氧；過氧化氫酶；超氧化物歧化酶

[中圖分類號] R737.250.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（b）-0017-04

Effects of high glucose state on oxidative stress in prostate cancer cells

ZHANG Zhitao1 ZHANG Hongyan2 NIU Fangfang1

1.The Second Department of Uropoiesis Surgical， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056001， China； 2.Department of Inspection， Medical College of Hebei Engineering University ， Hebei Province， Handan 056001， China

[Abstract] Objective To explore the effects of high glucose state on oxidative stress in prostate cancer cells. Methods Human prostate cancer cell line LNCap was treated with different glucose concentrations， and the level of LNCap cells reactive oxygen species （ROS） was detected by DCFH-DA fluorescent probe. The hydrogen peroxide （H2O2）， total superoxide dismutase （T-SOD）， catalase （CAT） and glutathione peroxidase （GPX） kits were used to detect H2O2 level and antioxidant enzymes activities in LNCap cells. Western blot was used to detect the expression levels of SOD1 and SOD2 protein in LNCap cells. The level of H2O2 was detected after LNCap cells transfected with si-SOD2. Results The levels of ROS and H2O2 in LNCap cells were increased with the increase of glucose concentration， and were concentration-dependent （P < 0.05）. The activities of T-SOD and CAT in LNCap cells were increased significantly in the high glucose environment （P < 0.05）， but there was no significant change in the activity of GPX （P > 0.05）. In the high glucose environment， the expression level of SOD2 in LNCap cells was increased significantly （P < 0.05）， but the expression level of SOD1 was not significantly changed （P > 0.05）. After the SOD2 gene was silenced， the level of H2O2 in the LNCap cells was decreased significantly in the high glucose environment （P < 0.05）. Conclusion High glucose state can promote the oxidative stress level of prostate cancer cells， and the increase of H2O2 level may be regulated by the expression of SOD2.

[Key words] High glucose； Prostate cancer cells； Reactive oxygen species； Catalase； Superoxide dismutase

前列腺癌是常見于中老年男性的惡性腫瘤，發(fā)病率隨年齡增長而升高，死亡率在男性惡性腫瘤中位居第二，僅次于肺癌[1]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，一般由胰島素功能障礙或分泌減少引起[2]。許多研究認為2型糖尿病與多種實體惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、大腸癌等[3-8]。有研究顯示，氧化應(yīng)激可促進前列腺癌的發(fā)生[9-10]。所以本研究從細胞水平上觀察高糖對前列腺癌細胞氧化應(yīng)激的影響，以揭示糖尿病對前列腺癌發(fā)病影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人前列腺癌細胞株LNCap（BNCC337702）購自于ATCC；無糖型RPMI1640 培養(yǎng)基（SH30809.01B）、胰酶（SH30042.02）、胎牛血清（SH30370.03）購自美國Hyclone公司；葡萄糖（G8270-100G）購自美國Sigma公司；活性氧（ROS）（S0033）、過氧化氫（H2O2）（S0038）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）（S0101）、過氧化氫酶（CAT）（S0051）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）（S0056）檢測試劑盒以及Western blot顯色劑（P0203）購自江蘇碧云生物技術(shù)研究所；小干擾RNA（si-SOD2）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；SOD1單抗（FL-154）和SOD2單抗（G-20）購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組 取LNCa細胞分別在含有5.5、12.5、25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為實驗對象，分別為5.5 mmol/L Glu組、12.5 mmol/L Glu組、25 mmol/L Glu組，另取LNCa細胞在含有5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L 甘露醇（滲透壓相同）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為對照，為5.5 mmol/L Glu+Mannitol組。各組培養(yǎng)48 h后，采用不同方法進行相應(yīng)指標(biāo)檢測。轉(zhuǎn)染si-SOD2后，更換25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的LNCa細胞視為25 mmol/L Glu+si-SOD2組。

1.2.2 ROS含量檢測 將生長狀態(tài)良好的LNCap細胞消化，吹打均勻后離心重懸，調(diào)整細胞濃度至6×105/孔接種到6孔板中，分別進行不同干預(yù)處理后，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。DCFH-DA采用無血清培養(yǎng)基稀釋（1∶1000），使終濃度為10 μmol/L。去除培養(yǎng)基，每孔加入1 mL DCFH-DA，在37℃下孵育20 min，然后用無血清培養(yǎng)基洗滌2～3次，胰酶消化后重懸，采用流式細胞儀檢測DCFH-DA熒光強度。

1.2.3 H2O2含量檢測 將LNCap細胞消化后收集至離心管內(nèi)，3000 r/min離心5 min（半徑：8.52 cm）后棄上清，加入H2O2檢測裂解液，在細胞充分裂解后，低溫離心，收集上清，待檢測。按照試劑盒說明書將標(biāo)準溶液按比例依次稀釋。選取96孔板。每孔加入樣品或標(biāo)準品各50 μL，然后加入H2O2檢測試劑100 μL。采用酶標(biāo)儀在波長為560 nm時測定吸光度，并根據(jù)繪制的標(biāo)準曲線計算樣品中H2O2含量。

1.2.4 T-SOD活性檢測 收集LNCap細胞，加入細胞裂解液將細胞充分裂解，將待測樣品分別加入對照溶液、WST工作液和酶工作液，混勻后在37℃下孵育20 min，采用酶標(biāo)儀在波長為450 nm時測定吸光度，并計算SOD酶活力。

1.2.5 CAT活性檢測 收集LNCap細胞，充分裂解細胞，調(diào)整蛋白終濃度至0.2 mg/mL。按照試劑盒說明書將標(biāo)準溶液按比例依次稀釋。取裂解液5 μL加入EP管，然后加入CAT檢測緩沖液35 μL，充分混勻后再加入H2O2溶液10 μL，在室溫下反應(yīng)5 min，加入CAT反應(yīng)終止液450 μL。另取EP管，加入CAT檢測緩沖液40 μL和上述已終止的反應(yīng)體系10 μL至96孔板中，最后加入H2O2顯色液200 μL。室溫下孵育20 min后，采用酶標(biāo)儀在波長為520 nm時測定吸光度，并計算CAT活性。

1.2.6 GPX活性檢測 收集LNCap細胞，加入細胞裂解液將細胞充分裂解，在96孔板中加入GPX緩沖液、待測樣品以及GPX檢測工作液混勻，然后加入過氧化物溶液，再次混勻，采用酶標(biāo)儀在波長為340 nm時測定吸光度，并計算GPX活性。

1.2.7 Western blot檢測 提取細胞總蛋白，測量待測蛋白樣本濃度，并使之標(biāo)準化。經(jīng)加熱變性、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育，SOD1和SOD2和GAPDH單抗均按1︰1000稀釋，二抗按1︰5000稀釋。最后在暗室顯影并拍照，采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.2.8 轉(zhuǎn)染實驗 待LNCap細胞密度長至75%～80%，根據(jù)Lipofectamine TM 2000說明步驟將SOD2沉默效果較好的si-SOD2轉(zhuǎn)染至LNCap細胞，更換培養(yǎng)基時采用含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，然后提取總蛋白進行Western blot檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖對前列腺癌細胞總ROS的影響

結(jié)果顯示，12.5 mmol/L Glu組和25 mmol/L Glu組ROS水平明顯高于5.5 mmol/L Glu組（P < 0.05），25 mmol/L Glu組ROS水平明顯高于12.5 mmol/L Glu組（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol組與5.5 mmol/L Glu組ROS水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 高糖對前列腺癌細胞H2O2的影響

結(jié)果顯示，12.5 mmol/L Glu組和25 mmol/L Glu組H2O2水平明顯均高于5.5 mmol/L Glu組（P < 0.05），25 mmol/L Glu組H2O2水平明顯高于12.5 mmol/L Glu組（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol組與5.5 mmol/L Glu組H2O2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 高糖對前列腺癌細胞抗氧化酶活性的影響

結(jié)果顯示，12.5 mmol/L Glu組和25 mmol/L Glu組總SOD活性和CAT活性均明顯高于5.5 mmol/L Glu組（P < 0.05），25 mmol/L Glu組總SOD活性明顯高于12.5 mmol/L Glu組（P < 0.05）；5.5 mmol/L Glu+Mannitol組與5.5 mmol/L Glu組總SOD活性和CAT活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。各組GPX活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 高糖對前列腺癌細胞SOD1和SOD2表達的影響

結(jié)果顯示，12.5 mmol/L Glu組和25 mmol/L Glu組SOD2蛋白表達水平高于5.5 mmol/L Glu組（P < 0.05）；25 mmol/L Glu組SOD2蛋白表達水平高于12.5 mmol/L Glu組（P < 0.05）；但各組SOD1蛋白表達水平無明顯變化（P > 0.05）。見圖4。

2.5 SOD2對H2O2的調(diào)控作用

結(jié)果顯示，25 mmol/L Glu+si-SOD2組H2O2水平較25 mmol/L Glu組明顯下降（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

許多流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病會影響前列腺癌的發(fā)生，與正常人群比較，糖尿病患者發(fā)生前列腺癌的風(fēng)險較低[11]。隨后，有報道通過調(diào)查美國糖尿病退伍軍人癌癥發(fā)病率，發(fā)現(xiàn)患有糖尿病的白種人和黑種人前列腺癌發(fā)病率明顯降低[12]。而國內(nèi)許多研究認為糖尿病與前列腺增生、前列腺癌等疾病發(fā)病呈正相關(guān)[13-14]。

有研究報道，良性前列腺增生與前列腺癌細胞中的氧化應(yīng)激指標(biāo)存在明顯差異，前列腺癌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯較強[15]。氧化應(yīng)激是機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化系統(tǒng)加強，抗氧化系統(tǒng)減弱，導(dǎo)致蛋白酶分泌增加、炎性細胞浸潤、氧化中間產(chǎn)物增多的狀態(tài)[16]。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及誘發(fā)的細胞增殖會對血管正常生理狀態(tài)造成影響，引起細胞突變或增殖分化，加速前列腺細胞增殖和重塑，在前列腺癌發(fā)生過程中起到一定作用[17]。在正常生理狀態(tài)下，ROS可作為第二信使參與細胞生理機能調(diào)控，但當(dāng)ROS水平過高時，則會引起染色體變異、細胞凋亡以及腫瘤形成[18]。所以本研究著重于研究糖尿病與氧化應(yīng)激的關(guān)系，在細胞水平上營造高糖環(huán)境，觀察高糖對LNCap細胞氧化應(yīng)激的影響。

ROS主要包括超氧陰離子、H2O2、羥自由基等，是氧氣衍生的多種化學(xué)分子的統(tǒng)稱。本研究結(jié)果顯示，LNCap細胞內(nèi)ROS水平隨著葡萄糖濃度增加而增加，H2O2作為ROS中重要成分之一，也隨著葡萄糖濃度增加而增加；抗氧化系統(tǒng)的總SOD、CAT活性隨著葡萄糖濃度增加而增加，GPX無明顯變化，且均與滲透壓無關(guān)。以上結(jié)果提示，LNCap細胞在高糖環(huán)境下處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，SOD和CAT等抗氧化酶水平的升高可能與細胞代償反應(yīng)有關(guān)。SOD是機體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一，是唯一可清除體內(nèi)超氧陰離子的抗氧化酶，通過歧化反應(yīng)將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，產(chǎn)生的H2O2再在CAT和GPX等酶作用下分解為水和氧氣等無害物質(zhì)[19]。SOD1和SOD2是SOD的兩個不同亞型，SOD1活性位點含有鋅和銅，SOD2 活性位點含有錳[20]。為了探討總SOD中受到高糖影響的是SOD1還是SOD2，本研究采用Western blot檢測不同葡萄糖濃度下LNCap細胞表達SOD1和SOD2的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD1表達水平不受葡萄糖濃度影響，而SOD2表達水平隨葡萄糖濃度升高而增強，提示高糖可增強LNCap細胞中SOD2的表達。將SOD2基因沉默后，H2O2水平也明顯降低，說明H2O2水平升高可能與高糖環(huán)境下SOD2表達增強有關(guān)。

綜上所述，高糖可明顯升高前列腺癌細胞中ROS和H2O2水平，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中H2O2水平受SOD2抗氧化酶調(diào)控，H2O2能否對腫瘤發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響還需進一步研究。本研究初步揭示了糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)可能是影響前列腺發(fā)病的原因之一，為糖尿病合并前列腺癌患者的治療提供了新方向。

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（收稿日期：2018-01-31 本文編輯：任 念）