梅新宇 程 民 王 亮 解明然 吳顯寧

(中國科學技術(shù)大學附屬第一醫(yī)院 安徽省立醫(yī)院胸外科，安徽 合肥 230001)

目前世界上食管癌死亡率占所有腫瘤死亡率第六位〔1,2〕，亞洲國家主要病理類型為鱗狀細胞癌〔3〕。DNA甲基化為重要的表觀遺傳學改變，指的是腺嘌呤(A)或者胞嘧啶(C)的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下與甲基發(fā)生共價結(jié)合的現(xiàn)象〔4〕。抑癌基因甲基化會致抑癌基因表達缺失或抑制，導致腫瘤發(fā)生，而食管鱗癌中多種調(diào)控細胞凋亡、細胞周期和細胞信號轉(zhuǎn)導的抑癌基因甲基化也是食管鱗癌形成的原因之一〔5,6〕。放射治療是臨床食管鱗癌治療的重要組成部分，放射抵抗是放療失敗或腫瘤局部復發(fā)的重要原因〔7，8〕。本研究旨在探討CHFR/CDKN2A抑癌基因的DNA甲基化在放射抵抗中的生物學意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 食管鱗癌細胞系(KYSE150細胞、KYSE180細胞，中科院上海細胞庫)，RPMI1640 培養(yǎng)基(Thermo scientific公司)，胎牛血清(天杭生物科技公司)，胰蛋白酶(Solarbio)，二甲基亞砜(Sigma)及75%乙醇；實驗儀器包括超凈工作臺、CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、電泳儀、流式細胞儀、超低溫冰箱、熒光定量PCR儀、平底型 96 孔培養(yǎng)板及PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀等。

1.2細胞輻照實驗 將存放有食管鱗癌KYSE150，KYSE180的細胞凍存管取出，復蘇后進行傳代培養(yǎng)，將在對數(shù)生長期生長的KYSE150，KYSE180細胞制作為細胞懸液，以每孔1×105個細胞分別種在6孔板中，待觀察見細胞貼壁并狀態(tài)良好時,將細胞貼壁生長至 80%且處于對數(shù)生長期的KYSE150，KYSE180細胞分別給予高能量 X 線(室溫下條件下由 Varian CX直線加速器 6 MV-X 線分別給予8 Gy 的 X 線照射。源距離標本100 cm，照射野為 20 cm×20 cm，吸收劑量率為 1.50 Gy/min)。照射后，立即將其制成單細胞懸液(以0.25%胰蛋白酶消化并獲得單細胞懸液后計數(shù))，按照1 d、3 d、5 d、7 d 分為 4 組，平均接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，將細胞置入 37℃、5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適當添加培養(yǎng)液，及時換培養(yǎng)液，直至放射抵抗的細胞克隆在細胞凋亡、壞死后形成。

1.3KYSE150，KYSE180細胞及KYSE150-8 Gy和KYSE180-8 Gy細胞DNA提取及甲基化測序 細胞系樣本DNA提取，并經(jīng)亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化后，采用PyroMark Assay design2.0針對CDKN2A和CHFR基因啟動子CpG島設(shè)計PCR引物和測序引物(設(shè)計結(jié)果:CDKN2A，正義：TTGAGGAGAGGGGGAGAGTAGGT，反義：CAAACCCTCTACCCACCTAAAT。CHFR,正義：GGGGAGGGGTTAGAGGTTTTTG，反義：TTCCCCCTCCCTTCTACCCCAACA)。按PyroMark PCR Kit試劑盒(德國，Qiagen)說明書要求完成焦磷酸測序前的PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)體系為：去離子水6 μl，混合物12.5 μl，上游引物2 μl，下游引物2 μl，CoralLoad Concentrate 2.5 μl，共25 μl。反應(yīng)條件如下：①95℃條件下預變性15 min；②94℃條件變性30 s；③56℃條件退火30 s；④72℃條件延伸30 s；⑤PCR在以上條件循環(huán)45次；⑥72℃溫度延伸10 min。DNA擴增后將堿基、酶及底物加入容器并置入Q96或Q24儀器，在酶標版的每根管中準備預備好的微珠預混液，打開CpG軟件進行焦磷酸測序。

1.4KYSE150，KYSE180細胞及KYSE150-8 Gy和KYSE180-8 Gy細胞mRNA提取與檢測 采用氯仿處理樣本，提取樣本總RNA；按序加入RT反應(yīng)的混合物，預留一個RT反應(yīng)的量；取14 μl RT反應(yīng)的混合物加入每根Ep管中，充分混勻后短暫離心，收集產(chǎn)物；37℃，孵育50 min，70℃，RT反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，產(chǎn)物進行實時定量PCR 反應(yīng)。

1.5放射抵抗細胞系與原始細胞系細胞增殖實驗 KYSE150、KYSE150-8 Gy、KYSE180及KYSE180-8 Gy細胞起始接種濃度為1×105/瓶，分別于1,3,5,7 d消化后計數(shù)，配對比較細胞系增殖能力。

1.6統(tǒng)計學分析 采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌細胞系甲基化程度 KYSE150細胞中CHFR基因甲基化程度為42.33%，放射抵抗細胞系KYSE150-8 Gy細胞中甲基化發(fā)生率為75.22%，放射抵抗細胞系CHFR基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細胞系(P<0.05)；而在KYSE180細胞系和放射抵抗細胞克隆KYSE150-8 Gy細胞系中發(fā)生率分別為7.36%和25.93%，放射抵抗細胞系CHFR基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細胞系(P<0.05)。

食管鱗癌細胞系KYSE150細胞中CDKN2A基因甲基化程度為54.59%，放射抵抗細胞系KYSE150-8 Gy細胞中甲基化發(fā)生率為85.22%，放射抵抗細胞系CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細胞系(P<0.05)；而在KYSE180細胞系和放射抵抗細胞克隆KYSE150-8 Gy 細胞系中發(fā)生率分別為12.68%和36.96%，放射抵抗細胞系CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著高于原始細胞系(P<0.05)。

2.2CDKN2A及CHFR基因mRNA表達 放射抵抗的KYSE150-8 Gy，KYSE180-8 Gy細胞系中CDKN2A基因mRNA(10.070±0.026，0.122±0.072)及CHFR基因mRNA的表達(0.167±0.096，0.219±0.124)顯著低于原始的KYSE150，KYSE180細胞系(1.000，1.000，1.000，1.000)(P<0.05)。

2.3細胞增殖 KYSE150-8 Gy，KYSE180-8 Gy細胞系增殖能力顯著高于KYSE150，KYSE180細胞系(P<0.05)。見圖1。

圖1 KYSE150、KYSE150-8 Gy、KYSE180及KYSE180-8 Gy細胞的增殖情況

3 討 論

放射治療是臨床食管鱗癌綜合治療的重要手段,影響食管鱗癌放射療效的主要因素有鱗癌組織對放射線的敏感程度及癌組織對射線的耐受程度。其中放射抵抗是導致放療失敗(無效)或癌腫復發(fā)的重要原因〔7，8〕。目前在對腸癌、胃癌、乳腺癌、頭頸鱗癌的研究〔9，10〕發(fā)現(xiàn)，對發(fā)生甲基化改變的基因進行去甲基化處理可以增強腫瘤細胞在射線治療時的細胞毒作用，增加對射線的敏感，減少放射抵抗。食管鱗癌抑癌基因CHFR及CDKN2A的DNA甲基化具有較高的發(fā)生率。Shibata 等〔11〕檢測了 15 個食管癌細胞系，其中TE5、TE6、TE9 和 TE14 細胞系的CHFR mRNA表達缺失。Morioka等〔12〕研究了38 例原發(fā)食管癌腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)其中23.7%(9例)發(fā)生了甲基化，而食管正常組織中均未測到甲基化發(fā)生；CDKN2A基因啟動子區(qū)異常甲基化在食管兩種主要病理類型即鱗狀細胞癌和腺癌中也有比較高的發(fā)生頻率〔13,14〕。放射抵抗的細胞系中CHFR及CDKN2A基因甲基化可能是導致食管鱗癌放射抵抗重要原因，抑癌基因失活后所致的mRNA低表達導致抑癌基因蛋白產(chǎn)物的缺失，繼而失去了對鱗癌細胞的抑制作用，使腫瘤的損傷修復與抗凋亡能力增強從而發(fā)揮了抗放射作用，這可能是導致食管鱗癌放射抵抗的機制之一。本文說明放射抵抗的食管鱗癌細胞具有更為惡性的生物學行為。因此，抑癌基因CHFR及CDKN2A甲基化削弱了其生物學功能，對其進行檢測和干預有助于臨床預測食管鱗癌的生物學行為、放射敏感性及放射抵抗特性，也為后續(xù)食管鱗癌放射增敏方法研究奠定基礎(chǔ)。