張慶龍

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌5年生存率僅為15%(NSCLC)[1]。盡管目前化療和放療取得了巨大進(jìn)步，但肺癌生存率并沒有取得顯著改善[2]。細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42蛋白)是Rho家族中的鳥嘌呤三核苷酸活化酶[3]，在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架變化，囊泡運(yùn)輸以及其他的細(xì)胞生長和穩(wěn)定性調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。相關(guān)研究提示，Cdc42在一系列癌細(xì)胞中存在高表達(dá)[5-6]。表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜蛋白與其表達(dá)肺癌細(xì)胞生長速度呈正相關(guān)，在臨床上與可作為肺癌患者預(yù)后指標(biāo)之一[7]。有報(bào)道證實(shí)肺癌預(yù)后較差的患者中多見EGFR的高表達(dá)[8]。本研究針對Cdc42基因合成siRNA，觀察其對肺癌A549細(xì)胞增殖能力以及EGFR蛋白表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討Cdc42在肺癌的作用提供有力實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與試劑 肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司。qRT-PCR 反應(yīng)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa。Trizol購自美國Invitrogen公司。鼠抗人GAPDH、EGFR及Cdc42單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。siRNA Transfection Reagent購自普飛生物公司。遷移小室購自美國millipore公司；Cdc42引物由生工生物技術(shù)公司完成，Cdc42上游引物：5，- ATGTCTTCGGAGATACGTCCTT-3，，下游引物5，- GACTCTGCGAACCTGTTGGA-3，。特異性干擾Cdc42基因的siRNA 序列購自廣州瑞博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度至滿視野70%時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化用于傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長時(shí)期的A549細(xì)胞用胰酶消化后以2×105每孔的密度接種于6孔板中，24 h當(dāng)細(xì)胞生長融合至80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將特異性干擾Cdc42-siRNA和無意義小干擾RNA分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中。將細(xì)胞分為特異性干擾Cdc42-siRNA實(shí)驗(yàn)組，無意義小干擾RNA陰性對照組和空白對照組。

1.2.2 qPCR法檢測A549細(xì)胞中Cdc42 的mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染24 h至48 h后，分別用 TRIzol 法提取實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組各組細(xì)胞的總RNA，NanoDrop2000c測定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系為20 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)3次檢測Cdc42基因的mRNA表達(dá)水平。

1.2.3 Western-blot法檢測Cdc42及EGFR蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48～72 h以后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA方法測定蛋白濃度。上樣量為200 μg，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上、5%BSA封閉漂洗后，加入Cdc42抗體、EGFR抗體及抗內(nèi)參照GAPDH抗體4 ℃過夜。次日用PBS在室溫洗膜3次后室溫孵育相應(yīng)的二抗90 min，PBS洗膜3次后使用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯影曝光。

1.2.4 CCK8方法檢測A549細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染特異性干擾Cdc42-siRNA和無意義siRNA 48 h細(xì)胞生長融合至80%，胰蛋白消化后以1×104/孔的密度接種于96孔板中，按照CCK8試劑盒要求檢測各孔的吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0及GraphPad軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及q檢驗(yàn)。兩組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 特異性干擾Cdc42-siRNA抑制A549細(xì)胞中Cdc42 mRNA的表達(dá) qPCR檢測結(jié)果表明，Cdc42-siRNA組中Cdc42 mRNA的表達(dá)較對照組明顯降低，實(shí)驗(yàn)組Cdc42 mRNA表達(dá)量顯著下降72%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見表1、圖1。結(jié)果提示Cdc42-siRNA轉(zhuǎn)染能有效地在轉(zhuǎn)錄水平上下調(diào)Cdc42 mRNA的表達(dá)。與陰性對照組相比：P=0.001t=8.142。

表1 各組A549細(xì)胞Cdc42 mRNA表達(dá)水平

2.2 Cdc42-siRNA抑制A549細(xì)胞中Cdc42 蛋白的表達(dá) Western-blot結(jié)果顯示Cdc42-siRNA組Cdc42 蛋白的表達(dá)水平與對照組相比明顯降低，取Cdc42/GAPDH的灰度值比值Cdc42-siRNA組Cdc42 蛋白的表達(dá)水平下降了54%，具有顯著差異(P<0.01)，結(jié)果見表2、圖2。結(jié)果表明Cdc42-siRNA能有效下調(diào)Cdc42的蛋白表達(dá)。

表2 各組A549細(xì)胞Cdc42蛋白表達(dá)水平

2.3 Cdc42表達(dá)下調(diào)可抑制A549細(xì)胞增殖能力 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞生長速率在Cdc42基因低表達(dá)時(shí)顯著減慢，在轉(zhuǎn)染第4天具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，轉(zhuǎn)染第5天有顯著差異(P<0.01)。說明Cdc42表達(dá)下調(diào)對A549細(xì)胞增殖能力起到抑制作用，結(jié)果見表3、圖3。

2.4 Cdc42表達(dá)下調(diào)抑制A549細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá) Western-blot檢測結(jié)果顯示，Cdc42-siRNA轉(zhuǎn)染后，Cdc42-siRNA組較對照組EGFR 蛋白的表達(dá)明顯降低，灰度分析Cdc42-siRNA組EGFR 蛋白表達(dá)量顯著下降78%，有顯著差異(P<0.01)，結(jié)果見表4、圖4。以上結(jié)果說明Cdc42-siRNA能抑制A549細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)。

表3 各組A549細(xì)胞增殖數(shù)目的變化

表4 各組A549細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平

3 討 論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率有逐年增長的態(tài)勢。肺癌細(xì)胞通過惡性增殖遷移，脫離正常體內(nèi)細(xì)胞生長調(diào)控，逐漸侵襲正常細(xì)胞。因此在肺癌的形成過程中，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖遷移發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[9]。

Cdc42在正常細(xì)胞中的基本生命過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。同時(shí)Cdc42作為癌基因，Cdc42過度活化也會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生機(jī)率增加在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等調(diào)控過程中發(fā)揮作用[10-11]。EGFR在一系列癌細(xì)胞中均有表達(dá)，通過激活增殖相關(guān)的信號通路從而加速腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。研究顯示，在肺癌術(shù)后患者中，EGFR的表達(dá)水平與生存率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[12]。因此我們推斷通過藥物降低EGFR表達(dá)水平可以在臨床上增強(qiáng)抗腫瘤的療效。

在目前臨床上，隨著EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的研發(fā)，肺癌分子靶向治療讓很多患者受益，但是單有效靶點(diǎn)突變率較低或未突變肺癌患者不能獲益，因此尋找新的分子靶點(diǎn)有著非常重要的意義。mRNA對特定靶基因的抑制能夠通過siRNA與其沉默相互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)。目前小干擾RNA已成為腫瘤分子靶相治療的研究熱點(diǎn)[13]。相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，Cdc42的表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)增強(qiáng)。通過靶向干擾Cdc42，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。但是針對Cdc42的特異性siRNA在肺癌A549細(xì)胞中的增殖觀察尚未見報(bào)道。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示A549肺癌細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染Cdc42-siRNA后，其增殖速度明顯減弱，同時(shí)EGFR表達(dá)水平顯著下降。由此我們推斷A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染Cdc42-siRNA后可能通過EGFR表達(dá)水平下降抑制Ras信號通路，從而抑制肺癌細(xì)胞的惡性增殖。肺癌的形成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程，本文研究結(jié)果提示Cdc42在A549肺癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。

(此文圖1-4見附頁3-4)

文見第9-11頁

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：實(shí)驗(yàn)組
圖1 RT-PCR檢測Cdc42 mRNA表達(dá)水平(**P<0.01)

A：Western blot結(jié)果 B:統(tǒng)計(jì)分析定量圖；1：陰性對照組；2：實(shí)驗(yàn)組
圖2 Western blot檢測Cdc42蛋白表達(dá)水平(**P<0.01)

圖3 Cdc42-siRNA抑制A549細(xì)胞增殖(*P<0.05，**P<0.01)

A：Western blot結(jié)果；B:統(tǒng)計(jì)分析定量圖；1：陰性對照組；2：實(shí)驗(yàn)組
圖4 Western blot檢測EGFR蛋白表達(dá)水平(**P<0.01)