毛慧子，田洪陽(yáng)

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)三病區(qū);2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121000)

急性心肌梗死早期再灌注治療，無(wú)論是溶栓或急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈(冠脈)介入治療，都是挽救心肌最廣泛采用的方法[1]。然而，人們發(fā)現(xiàn)在心肌組織血流恢復(fù)后反而出現(xiàn)了組織細(xì)胞損傷加重的狀態(tài)，即缺血再灌注損傷，引起心肌功能障礙及心律失常的發(fā)生，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。如何減輕再灌注損傷已經(jīng)成為目前的研究熱點(diǎn)。冠心舒通膠囊以廣棗 、丹參、丁香 、冰片、天竺黃等中藥藥材以一定的比例所組成，是在現(xiàn)代中醫(yī)藥理論與蒙醫(yī)蒙藥理論相互貫通結(jié)合的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)研制所成，冠心舒通膠囊有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、行氣止痛的功效[3]。已有研究[3]451-453顯示冠心舒通膠囊對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。本研究欲通過(guò)建立大鼠心肌缺血再灌注模型，擬研究冠心舒通膠囊通過(guò)調(diào)節(jié)p53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)蛋白的表達(dá)，保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷，并探討其可能機(jī)制。

1 儀器和材料

1.1 儀器 DH-150型動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠(chǎng))；BIO-RAD電泳槽(美國(guó)伯樂(lè)公司)；DNM-9602G酶標(biāo)分析儀(上海京工實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 冠心舒通膠囊由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供，規(guī)格為0.3克/粒，生產(chǎn)批號(hào)為100519。凱基TUNEL(原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù))細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。兔抗大鼠p53多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。兔抗大鼠Caspase-9多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-0007。

2 方 法

2.1 分組和給藥 健康成年雄性SD大鼠30只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為3組，每組10只：對(duì)照組(0.9%氯化鈉鹽水2 mL，日2次，早晚各1次)、缺血再灌注組(0.9%氯化鈉鹽水2 mL，日2次，早晚各1次)、冠心舒通膠囊組(冠心舒通膠囊組每次按1.5 g /kg，溶于2 mL生理鹽水中，每日2次灌胃，早晚各1次)，3組均連續(xù)灌服5 d。除對(duì)照組外，缺血再灌注組、冠心舒通膠囊組5 d后制作大鼠在體心肌缺血再灌注模型。

2.2 在體大鼠心肌缺血再灌注模型的建立[4]SD大鼠用10%烏拉坦(5 mg/kg)行腹腔麻醉后手術(shù)臺(tái)固定，取頸正中切口，分離頸總動(dòng)脈，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)動(dòng)脈插管取血。氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣。于胸骨左旁第2～3 肋間行縱行切口，分離胸大肌及肋間肌，結(jié)扎肋間動(dòng)靜脈，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜。在左心耳下緣冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)起始部處用6.0 聚丙烯紡織纖維線(xiàn)穿線(xiàn)，留線(xiàn)暫不結(jié)扎，待血壓、呼吸穩(wěn)定10～15 min后再收緊結(jié)扎線(xiàn)。結(jié)扎之前在預(yù)結(jié)扎的LAD處放置一根長(zhǎng)約0.5 cm、直徑1.5 mm的乳膠管。LAD 缺血30 min 后再松開(kāi)活結(jié)進(jìn)行再灌注，再灌注120 min。冠脈LAD結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎線(xiàn)遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)為ST段進(jìn)行性抬高和(或)T波高聳和(或)QRS高大增寬。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：剪斷結(jié)扎線(xiàn)后，心電圖ST段回落50%以上或者缺血部位心肌顏色恢復(fù)[3，5]451-453。

2.3 生化指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 肌酸激酶同工酶(CK-MB) 再灌注結(jié)束后，頸動(dòng)脈插管采血1.0 mL，離心(3 000 r·min-1，10 min)，取血清置于-80 ℃冰箱保存，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(日立7170A)測(cè)定CK-MB。

2.3.2 免疫印跡法(Westernblotting)測(cè)定p53、caspase-9的蛋白表達(dá) 取各組大鼠的心肌進(jìn)行蛋白制樣。蛋白質(zhì)樣品得制備及定量:取-80 ℃深低溫保存的心肌組織約100 mg，加入1 mL細(xì)胞裂解液，勻漿破碎，4 ℃離心15 000 r·min-1，30 min 取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，制成含蛋白量相等的樣品。行SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳。然后將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4 ℃封閉過(guò)夜；第2天，TBS洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下?lián)u床上孵育1 h；按Western blot發(fā)光試劑盒說(shuō)明書(shū)顯影，用Image J測(cè)定各蛋白的相對(duì)光密度值，以β-actin為內(nèi)參。

2.3.3 TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 再灌注120 min麻醉經(jīng)頸動(dòng)脈取血后，取出心臟，將缺血區(qū)心肌組織(左心室前壁中間段)剪下，10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行心肌組織切片細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)。光鏡下正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)綠色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域各取5個(gè)高倍視野，計(jì)算出平均100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)(%)表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量分析以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較比較應(yīng)用SNK法，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 血清CK-MB的測(cè)定 與正常組相比，模型組的CK-MB水平明顯上升(P<0.05)，與模型組相比，冠心舒通膠囊組CK-MB明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3.2 冠心舒通膠囊對(duì)心肌組織p53、Caspase-9的蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，其余各組的p53、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)，與模型組相比，冠心舒通膠囊組的p53、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

表1 冠心舒通膠囊對(duì)大鼠心肌CK-MB、凋亡指數(shù)的影響

注：與對(duì)照組相比★P<0.05；與模型組相比▲P<0.05

3.3 冠心舒通膠囊對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，其余各組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.05)，與模型組相比，冠心舒通膠囊組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減少(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖2。

4 討 論

冠心舒通膠囊系蒙古民間驗(yàn)方，臨床用于治療心血瘀阻型冠心病所引起的胸痛、胸悶心慌、氣短等癥，臨床研究證實(shí)其具有較好的抗心絞痛作用。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其具有抗心肌缺血、抗缺氧、降脂等作用[3，6]451-453。心肌缺血再灌注損傷是指急性缺血的心肌再恢復(fù)血流后組織損傷反而加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象[7]。它是由多種炎癥因子及多細(xì)胞信號(hào)通路參與的復(fù)雜的炎癥損傷反應(yīng)，其具體機(jī)制涉及氧化應(yīng)激，線(xiàn)粒體損傷及鈣超載等[8]。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生過(guò)程中心肌細(xì)胞的過(guò)度凋亡是再一次導(dǎo)致心肌損傷的重要原因，心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡作為缺血再灌注損傷的早期事件，貫穿于缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程[9]。

細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種程序性的細(xì)胞死亡，參與心肌細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控基因有Bc1-2、p21、Fas、p53、熱休克蛋白及Caspase家族蛋白酶。p53是一種重要的抗癌基因，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[10]。研究[10]6507-6521表明p53基因是心肌細(xì)胞凋亡的激活因子，應(yīng)用抑制劑抑制p53基因的表達(dá)，可以減輕細(xì)胞的凋亡。p53可以從胞漿轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體表面，從而激活內(nèi)源性線(xiàn)粒體損傷途徑。Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，caspase-9作為該家族的重要一員，介導(dǎo)線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑的細(xì)胞凋亡過(guò)程，最終激活了Caspase-3這一細(xì)胞凋亡效應(yīng)基因，進(jìn)而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，冠心舒通膠囊組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降，CK-MB的水平也明顯降低，提示冠心舒通膠囊可以抑制大鼠缺血再灌注損傷所致的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)p53、Caspase-9途徑的蛋白表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，冠心舒通膠囊組心肌組織p53、Caspase-9的表達(dá)明顯下降，提示冠心舒通膠囊可能通過(guò)抑制p53、Caspase-9的表達(dá)，從而抑制內(nèi)源性線(xiàn)粒體損傷途徑的激活，減少心肌再灌注時(shí)的細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷。

綜上所述，冠心舒通膠囊可以明顯減少缺血再灌注后的心肌細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷，可能與其抑制p53、Caspase-9表達(dá)有關(guān)。本研究為冠心舒通膠囊能夠減輕再灌注損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但應(yīng)用于臨床，仍需大量臨床實(shí)驗(yàn)。

(此文圖1-2見(jiàn)附頁(yè)4)

文見(jiàn)第12-14頁(yè)

圖1 冠心舒通膠囊對(duì)大鼠p53、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

注：箭頭所指棕褐色為凋亡細(xì)胞
圖2 冠心舒通膠囊對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響