王文標

(上海泓濟環(huán)保科技股份有限公司，上海 200433)

HBF工藝(hybrid biological & fixed film technology)是在AO活性污泥法基礎上，結合生物膜法的優(yōu)勢而開發(fā)出的一種復合式生物膜-活性污泥法工藝[1]，填料是該工藝核心部分。研究表明，不同填料對生物膜法污水處理性能影響顯著[2-4]，在生物接觸氧化工藝處理生活污水中，軟性纖維填料較彈性立體填料和懸浮球型填料，對生活污水中有機物及氨氮的去除效果較好，且填料對生物膜法污水處理性能影響更顯著的是對氨氮的去除，而對去除COD的影響較小[4]。然而，在HBF工藝中，填料的不同對其污水處理性能有何影響尚不清楚。

填料的表面性質直接影響其對微生物掛膜性能及附著生物類型[5]。同時，生物膜結構的異質性和微生物分布的復雜性，為生物膜的內部傳質和外部傳質提供了不同的微環(huán)境[6]。為此，污水處理性能的差異可以通過附著生物量、生物相組成及反應器中的傳質行為等過程來實現(xiàn)[7]。譚沖等[8]發(fā)現(xiàn)不同填料反應器污水去除效率的差異原因可歸結為生物膜負載量及生物膜上的微生物菌群組成。Hoang等[9]分析了常溫和低溫下MBBR系統(tǒng)中生物膜的結構，發(fā)現(xiàn)傳質的差異可導致生物膜中微生物結構的差異。然而，HBF工藝中不同填料反應器的污水處理性能差異的主要原因并不清楚。

為此，本文開展以下內容的研究：(1)研究不同填料對HBF反應器污水處理效率的影響；(2)不同填料反應器內生物膜干重及脫氫酶活性，揭示其差異形成的初步機制；(3)基于細菌群落結構組成和熒光定量PCR分析，揭示不同填料污水處理性能差異的微生物學機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的填料包括酶浮填料(MT)、聚酯填料(JT)、滌綸填料(DT)、軟性填料(RT)、彈性填料(TT)和組合填料(ZT)。采用人工裁剪方式，將前3種填料剪成條狀(2 cm×15 cm)，固定在ZT配套的骨架上，且底端固定填料以保證其在反應池中相對穩(wěn)定的狀態(tài)。6種填料性質及掃描電子顯微鏡(SEM)圖分別如表1、圖1所示。

表1 試驗填料及其性質Tab.1 Tested Fibers and Characteristics

注：填料理化性質由上海迅夷檢測設備有限公司測定

2.2 試驗裝置及運行工況

采用有機玻璃反應器(圖2)實施廢水處理。反應器有效體積為6 L，其污泥濃度(MLSS)為3 000 mg/L，DO為5 mg/L，污泥回流比為100%。反應器采用連續(xù)進出水，HRT設置為4～12 h(表2)。人工配置的污水pH值為7.0，CODMn濃度為250 mg/L，TN濃度為50～90 mg/L，TP濃度為3 mg/L及部分微量元素。

2.3 水質指標與分析方法

表2 各階段工況Tab.2 Working Conditions at Various Stages

2.4 生物膜量及微生物活性測定方法

采用干重法定量評價生物膜負載量[5]。將含有生物膜的溶液用0.45 μm濾膜(使用前稱重)過濾，把濾膜置于溫控105 ℃的恒溫鼓風干燥箱內，干燥至恒重，過濾前后的質量差即為生物膜干重。結果取各反應器運行第20、30、45、60 d及80 d所測結果的平均值。采用TTC-還原法[10]對脫氫酶活性進行測定。結果取各反應器運行第20、30、45、60 d及80 d所測結果的平均值。

圖2 反應器示意圖(1-原水池；2-泵；3-曝氣石；4-填料；5-采樣口；6-氣泵；7-出水池)Fig.2 Reactor Diagram(1-Influent Tank；2-Pump；3-Air Diffuser；4-Suspended Fibers；5-Sampling Port；6-Compressor；7-Effluent Tank)

2.5 微生物分析

2.5.1 DNA提取及PCR擴增

從每個反應器取適量的生物膜樣本，用Power Soil DNA提取盒(Qbiogene Inc.,Carlsbad,CA,USA)按照DNA提取盒內說明書提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。PCR 采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase。擴增采用的細菌16S rRNA引物序列為338F: 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R: 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[11]。AOB引物序列為amoA-1F: 5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′；amoA-2R: 5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′[12]。NOB引物序列為NSR1113R: 5′-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3′；NSR1264R: 5′-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3′[13]。

采用50 μL反應體系：10～100 ng模板，25 μL的2×Taq PCR MasterMix，1 μL的25 μmol/L引物，后用超純水補至50 μL。

PCR反應步驟：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。全部樣本按照正式試驗條件進行，每個樣本設置3個重復。

2.5.2 Miseq文庫構建和Miseq測序

利用NEBNext DNA文庫制備試劑盒(New England Biolabs公司，USA)在PCR產物兩端加上短接頭，構建出DNA文庫。經MiSeq reagent kit V2試劑盒(Illumina公司，USA)處理后，委托美吉生物采用MiSeq測序儀進行測序。

2.5.3 功能基因的熒光定量

使用實時熒光定量PCR(real-time qPCR)中SYBR Green方法對AOB 的amoA及NOB的NSR基因進行定量分析。試驗中設置陰性對照，每個樣品做3個平行，同時以梯度稀釋的質粒DNA和樣品DNA進行定量PCR反應。AOB及NOB 定量所用引物參見上述普通PCR擴增。擴增體系均為20 μL：SYBR Green Premix EX Taq酶(Takara，大連)10 μL，濃度為10 pmol/L AOB及NOB 正反向引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，用超純水補足至20 μL。采用IQ5 Thermocyler擴增儀(RG65HD，Corbett，Australia)進行定量PCR。定量PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。

3 結果與討論

3.1 填料對HBF反應器的污水處理效率的影響

圖3 不同填料反應器的COD(A)及氨氮(B)去除效率Fig.3 Removal Efficiency of COD(A) /Ammonia Nitrogen(B) in Different Filler Reactors

3.2 生物膜量及微生物活性分析

生物膜的形成與生長是實現(xiàn)污水處理的前提，生物膜量及活性是評價生物膜質量的重要依據(jù)[18-19]。在廢水生物處理中，生物膜脫氫酶活性可反映處理體系中活性微生物量及其對有機物的降解活性，因而成為評價生物膜活性的指標[20]。因此，為揭示不同填料反應器的去除效率差異較大的原因，按試驗方法測定了生物膜量及單位質量生物膜的脫氫酶活性，結果如圖4所示。

圖4 脫氫酶活性和生物膜干重及其與平均去除率回歸分析Fig.4 Dehydrogenase Activity and Dry Weight of Biofilm and Regression Analysis with the Average Removal Rate of Ammonia Nitrogen

3.3 生物膜中微生物群落結構分析

按試驗方法分析了生物膜的微生物群落。由樣本的層級聚類分析[圖5(A)]可知，六個樣品中的微生物群落可以分為三個不同的類群：第一類包括樣本S3、S5及S6；第二類為樣本S2；第三類包括樣本S1及S4。層級聚類分析結果與對生物膜樣本的PCoA主坐標分析[圖5(B)]結果一致。主坐標分析(principal coordinates analysis，PCoA)，可用來研究微生物群落組成的相似性或差異性。由圖5(B)可知，樣本S3、S5及S6聚集在一起，S1與S4聚集在一起，且均與S2相距較遠。以上結果說明不同填料上微生物組成存在差異。

注：S1-RT；S2-TT；S3-ZT；S4-JT；S5-MT；S6-DT圖5 生物膜樣本層級聚類分析(A)；細菌群落的PCoA分析(B)Fig.5 Hierarchical Cluster Analysis (A)；PCoA Analysis of Bacterial Community Structure (B) of Biofilm Samples

為進一步揭示其群落結構差異，基于細菌菌門水平(圖6)、變形菌門(表3)及菌屬水平(圖7)分析生物膜上的微生物群落結構組成。由圖6可知，從菌門水平來看，不同填料反應器中微生物群落組成的差異不是特別大。6種填料生物膜樣本的主要菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)及放線菌門(Actinobacteria)。以MT反應器為例，其生物膜樣本變形菌門占比達56.2%，其次是擬桿菌門(25.3%)、厚壁菌門(14.8%)。其他5種填料生物膜樣本上的變形菌門占比28%～54.3%，擬桿菌門占比23.5%～57.3%，厚壁菌門占比9.2%～16.1%。該結果與前人研究結果相近，如Ma等[21]在序批式反應器中發(fā)現(xiàn)的細菌群落組成中變形菌門(占比最大)、擬桿菌門及放線菌門占優(yōu)勢；Snaidr等[22]在常規(guī)活性污泥中對菌群多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢類群。在6個樣品中還有綠彎菌門(Chloroflexi)、浮酶菌門(Planctomycetes)、綠菌門(Chlorobi)及單胞菌門(Gemmatimonadetes)等，但所占比例均不同。其中綠菌門在顆?；^程中有重要作用，能夠增強污泥的沉降性能。

注：S1-RT；S2-TT；S3-ZT；S4-JT；S5-MT；S6-DT圖6 6種填料生物膜上細菌(門)相對豐度條形圖(>0.01%)Fig.6 Relative Abundance Barplot of Bacteria (Phylum) in Biofilm on Six Kinds of Biofilm(>0.01%)

表3 各生物膜樣本中變形菌門微生物的分布比例Tab.3 Distribution of Proteobacteria in Various Biofilm Samples

注：S1-RT; S2-TT; S3-ZT; S4-JT; S5-MT; S6-DT圖7 6種填料生物膜上細菌(屬)相對豐度熱圖(總豐度前30的物種)Fig.7 Relative Abundance Heat Map of Bacteria (Genus) in Six Types of Fillers (Total Abundances of First 30 Species)

如表3、圖7所示，從變形菌門微生物的分布、細菌菌屬水平分析可看出填料的差異對微生物群落組成形成了顯著差異。由圖6可知，各填料生物膜樣本中變形菌門的占比較大。變形菌門又分為五類，分別為α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和ε-變形菌綱。國內外研究[23]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門，其中β-變形菌綱包括某些AOB[包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira等)]在內等很多好氧或兼性菌，且AOB是其主要成員[24-25]；γ-變形菌綱則包括腸桿菌科(Enterobacteraceae)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)等；δ-變形菌綱包括脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、脫硫菌屬(Desulfobacter)及NOB類的硝化刺菌屬(Nitrospina)等菌屬。

由表3可知，各樣品中β-變形菌綱及γ-變形菌綱類較多，這與Lin等[26]在人工污水系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)最豐富的菌種為β-變形菌綱，其次是γ-變形菌綱結果相似。以MT生物膜樣本為例，β-變形菌綱、γ-變形菌綱及δ-變形菌綱占比分別達33%、16%及6%。

由圖7可知，在6個生物膜樣本中檢測出的假黃單胞菌屬(Pseudoxanthormonas)及不動桿菌屬(Acinetobacter)等菌屬已被證明具有硝化作用，其中假黃單胞菌屬能高效去除氨氮[27-28]。其中，MT生物膜樣本中假黃單胞菌屬占比達0.62%，不動桿菌屬占比達4%。在6個生物膜樣本中還檢測出了具有反硝化作用的熱單胞菌屬(Thermomonas)，主要原因可能是隨著微生物的生長，生物膜變厚，生物膜內部存在局部厭氧。

綜合以上對生物膜上微生物的群落結構分析結果可知，不同填料反應器中的微生物組成還是存在較大差異的。其中MT反應器生物膜樣本變形菌門占比最多。結合圖3(B)各反應器對氨氮的去除率，MT生物膜相比于其他5種填料生物膜可能存在相對較多的硝化菌，且包括大部分脫氮菌的變形菌門也占比最多(56.2%)。這可能就導致MT反應器的污水去除效果較好。為進一步確定各反應器生物膜樣本中硝化菌數(shù)量差異，本試驗對生物膜樣本上的硝化菌進行了功能基因(amoA、NSR)熒光定量PCR分析。

3.4 生物膜硝化功能基因(amoA、NSR)熒光定量分析

注：S1-RT; S2-TT; S3-ZT; S4-JT; S5-MT; S6-DT圖8 amoA和NSR基因的拷貝數(shù)Fig.8 Copy Numbers of amoA and NSR Genes

4 結論

本文采用RT、TT、ZT、MT、JT和DT 6種填料構建HBF反應器處理生活污水，以探討填料對污水處理性能的影響及其微生物學機制，主要結論如下。

(3)生物膜的生物活性取決于生物膜上微生物的功能菌群。微生物多樣性分析結果顯示，MT生物膜樣本中主要硝化細菌所在的變形菌門占比最大，達56.2%。硝化基因熒光定量PCR結果表明amoA及NSR基因拷貝數(shù)也最多(1.18×108、6.54×106copies/μL)，即AOB和NOB的數(shù)量最多。