臧福才 劉明月 劉敏 唐偉

[摘要] 目的 探討不同行為特征肺癌小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)及自然殺傷細(xì)胞（NK）的活性差異。 方法 Balb/c小鼠80只，雄性，進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，篩選高活躍組和低活躍組小鼠，每組各20只；取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC小鼠肺癌細(xì)胞，接種于高活躍組和低活躍組小鼠右腋皮下，建立小鼠肺癌模型。兩組相同條件飼養(yǎng)14 d后，MMT法檢測(cè)兩組小鼠脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性；游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑，計(jì)算腫瘤體積，電子天平稱(chēng)腫瘤重量；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組小鼠腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果 高活躍組小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性為（19.73±3.55）%，高于低活躍組[（16.47±3.29）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠腫瘤體積為（0.78±0.14）cm3，低于低活躍組[（0.94±0.24）cm3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠腫瘤重量為（0.84±0.19）g，低于低活躍組[（1.00±0.22）g]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為85.0%，明顯低于低活躍組（95.0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 不同活躍程度荷瘤小鼠肺癌組織生長(zhǎng)速度不同，可能與小鼠活躍程度影響NK細(xì)胞活性、腫瘤組織VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 行為特征；肺癌；NK細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）05（c）-0018-04

Study on the differences of the expression of vascular endothelial growth factor and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics

ZANG Fucai1 LIU Mingyue2 LIU Min1 TANG Wei1

1.Neurology Department， Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021， China； 2.the Second Radiotherapy Department， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056000， China

[Abstract] Objective To investigate the differences of the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics. Methods Eighty male Balb/c mice were taken open field test to screen high active group and low active group， with 20 mice in each group. The logarithmic phase LLC cells were inoculated in the right axillary subcutaneous of high active group and low active group to establish lung cancer model. After 14 days under the same feeding condition， the killing activity of spleen NK cells in the two groups was detected by MMT method. The long and short diameters of tumor were detected by vernier caliper， the tumor volume was calculated， and the tumor weight was measured by electronic scales. Immunohistochemistry method was used to detect the expression of VEGF in the two groups. Results The killing activity of NK cells in the high active group was （19.73±3.55）%， which was significantly higher than that of low active group [（16.47±3.29）%]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor volume of high active group was （0.78±0.14） cm3， which was smaller than that of low active group [（0.94±0.24） cm3]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor weight of high active group was （0.84±0.19） g， which was lower than that of low active group [（1.00±0.22） g]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of VEGF in the high active group was 85.0%， which was lower than that of low active group （95.0%）， there was statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Different activity degrees of tumor-bearing mice have different growth rates of lung cancer tissue， which may be connected with the activity of NK cells and the expression of VEGF protein in tumor tissue.

[Key words] Behavior characteristics； Lung cancer； NK cells； Vascular endothelial growth factor

癌癥是目前對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的疾病之一[1]。癌癥也是一種較為明確的身心疾病，個(gè)性行為特征和精神心理因素與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有著非常密切的關(guān)系。英國(guó)學(xué)者Greer等結(jié)合自己的研究結(jié)果，總結(jié)了癌癥患者的人格特征：壓抑自己，不善于將內(nèi)心的感受和不良情緒外泄，對(duì)生活事件所產(chǎn)生的負(fù)性情緒，壓抑到內(nèi)心世界[2]。處在開(kāi)放環(huán)境中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的特征與人存在相似之處。Dellu等[3]認(rèn)為高活躍程度的大鼠行為與性格開(kāi)朗、積極探索的人行為相似，低活躍程度的大鼠與消極態(tài)度、高度恐懼感和害羞感特征的人相似。

自然殺傷細(xì)胞（NK）既是機(jī)體內(nèi)的自然防御細(xì)胞，又兼有重要的免疫調(diào)節(jié)功能[4]。腫瘤血供豐富，其生長(zhǎng)離不開(kāi)血管的生成，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）起關(guān)鍵作用[5]。VEGF可誘發(fā)腫瘤血管進(jìn)行性聚集和生成，是目前已知作用最強(qiáng)的血管生成促進(jìn)因子，與肺癌發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系[6-7]。因此闡明不同心理行為特征在癌癥發(fā)展過(guò)程中的作用、個(gè)體行為的差異與腫瘤血管生成能力和免疫應(yīng)答之間的聯(lián)系，探討他們之間的機(jī)制對(duì)預(yù)防、治療癌癥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Balb/c小鼠80只，雄性，體重18～22 g，SPF級(jí)，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK2015-0002），飼養(yǎng)在24℃、12/12 h光照/黑暗交替的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，正常飲食，動(dòng)物適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料及儀器

小鼠LLC肺癌細(xì)胞（大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）；胎牛血清（FCS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液（朗頓生物技術(shù)有限公司）；兔抗小鼠VEGF多克隆抗體（博士得生物工程有限公司）；SP-9001免疫組化試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色劑（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱（LABNET公司）；低溫超速離心機(jī)（HITACHI公司）；BHC-1300Ⅱ超凈工作臺(tái)（東聯(lián)哈爾公司）；Katoo RT2100酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；石蠟切片機(jī)（Leica RM2135德國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）；顯微鏡（OLYMMPUS公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

LLC肺癌細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，將其培養(yǎng)于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液中（內(nèi)含100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3天傳代1次。

1.4 動(dòng)物分組

曠場(chǎng)試驗(yàn)：將小鼠輕輕地放于曠場(chǎng)試驗(yàn)（open field test）反應(yīng)箱中（曠場(chǎng)試驗(yàn)箱為50 cm×50 cm×30 cm的木質(zhì)箱，內(nèi)部涂為黑色，底面用白線劃分為等大的25個(gè)正方形小格子）。讓小鼠隨意活動(dòng)，記錄每只小鼠3 min內(nèi)穿越的格子數(shù)（由3個(gè)實(shí)驗(yàn)員共同完成）。將小鼠第2、3、4天行走距離的平均值作為分組標(biāo)準(zhǔn)：將穿越格子總數(shù)處在上四分之一位數(shù)的小鼠定義為高活躍組，將穿越格子總數(shù)處在下四分之一位數(shù)的小鼠定義為低活躍組[8]，每組各20只。

1.5 Balb/c小鼠實(shí)體荷瘤模型建立

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC細(xì)胞（長(zhǎng)滿(mǎn)80%），成瘤時(shí)間為1周，經(jīng)胰蛋白酶消化后，1200 r/min，離心4 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌腫瘤細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL以供注射。在無(wú)菌條件下接種于小鼠右腋皮下，每只小鼠接種0.2 mL細(xì)胞懸液（包含細(xì)胞數(shù)2×106），注射局部出現(xiàn)明顯皮丘。

1.6 脾臟NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定

1.6.1 效應(yīng)細(xì)胞制備 頸椎脫臼法處死小鼠后，立即將小鼠浸泡在75%醫(yī)用酒精中，2 min后無(wú)菌條件下取出小鼠脾臟，磷酸緩沖液（PBS）沖洗3遍，盡量洗凈血細(xì)胞，用眼科剪將脾臟剪碎，用10 mL玻璃注射器針芯在200目不銹鋼網(wǎng)篩中研磨、過(guò)濾，洗滌3次，制成脾細(xì)胞懸液3 mL，將其加入含有小鼠淋巴細(xì)胞分離液的試管中，然后1200 r/min離心4 min，收集白膜層，再用PBS洗滌，最后室溫下1640培養(yǎng)基孵育4 h，去除單核細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，然后1200 r/min離心4 min，收集離心的細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。

1.6.2 靶細(xì)胞制備 顯微鏡觀察LLC細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待LLC細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，將其制備LLC單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL備用。

1.6.3 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn) 將效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞各50 μL（效靶比為100∶1）加入到96孔板中，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和單獨(dú)靶細(xì)胞對(duì)照孔，在37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)4 h，之后每孔加入5 mg/L的噻唑藍(lán)（MTT）10 μL，繼續(xù)孵育4 h，之后再加入10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-50%二甲基甲酰胺（DMF）100 μL，待紫色結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)570 nm波長(zhǎng)的吸光度值（A）。NK細(xì)胞殺傷活性（%）=[1-（A效+靶-A效）/A靶]×100%。

1.7 觀察腫瘤組織的形態(tài)

處死小鼠后，剝離出腫瘤組織，剝離過(guò)程注意與周?chē)M織有無(wú)粘連，肉眼觀察腫瘤組織的大體形態(tài)，用電子天平稱(chēng)瘤重；采用精密游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體最大直徑（a）和最小直徑（b），計(jì)算腫瘤體積，并進(jìn)行兩組間的比較。腫瘤體積=1/2（a×b2）[7]。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá)

采用S-P免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色。VEGF陽(yáng)性細(xì)胞為胞質(zhì)著色，胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。判斷結(jié)果的方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，由兩名病理醫(yī)師雙盲法進(jìn)行閱片，載玻片上組織染色的陽(yáng)性反應(yīng)依據(jù)胞質(zhì)及胞核的染色程度：胞質(zhì)或胞核有棕黃色或棕褐色顆粒沉著即為陽(yáng)性染色。低倍鏡下選擇陽(yáng)性細(xì)胞最密集的區(qū)域，在高倍鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每100個(gè)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分比，取各視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞百分率的平均值。陽(yáng)性細(xì)胞0～10%為陰性（-）；陽(yáng)性細(xì)胞>10%～30%為弱陽(yáng)性（+）；陽(yáng)性細(xì)胞>30%～50%為陽(yáng)性（++）；陽(yáng)性細(xì)胞>50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），本研究將（+）～（+++）定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)試驗(yàn)

Balb/c小鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)量存在著相當(dāng)大的差距，穿越的格子數(shù)最少的為0個(gè)，最多的為139個(gè)，其中取高活躍組20只和低活躍組20只。

2.2 Balb/c小鼠肺癌模型建立

Balb/c小鼠接種LLC肺癌細(xì)胞后14 d，發(fā)現(xiàn)小鼠右腋下出現(xiàn)黃豆粒大小的腫塊，質(zhì)地堅(jiān)硬，小鼠的成瘤率為100%。

2.3 兩組小鼠NK細(xì)胞殺傷活性比較

高活躍組小鼠NK細(xì)胞的殺傷活性為（19.73±3.55）%，高于低活躍組[（16.47±3.29）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 兩組腫瘤組織的大體形態(tài)

頸椎脫臼法處死小鼠后，剝離腫瘤組織，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤組織呈灰紅色，質(zhì)地較硬，與周?chē)M織分界不清，存在粘連。高活躍組小鼠瘤體積為（0.78±0.14）cm3，低于低活躍組[（0.94±0.24）cm3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；高活躍組小鼠瘤重為（0.84±0.19）g，低于低活躍組[（1.00±0.22）g]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.5 兩組腫瘤組織中VEGF的表達(dá)情況比較

3 討論

癌癥的發(fā)生是多階段、復(fù)雜的演變過(guò)程。它不僅受到物理、化學(xué)、生物等因素的影響，同樣也受到精神心理因素的影響。隨著科技水平的進(jìn)步、人類(lèi)疾病譜的改變，生物醫(yī)學(xué)模式逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤吧?心理-社會(huì)”醫(yī)學(xué)模式，精神心理因素對(duì)疾病的影響日益受到醫(yī)學(xué)界的重視[10]。本研究采用小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)判別小鼠的活躍程度。曠場(chǎng)試驗(yàn)又稱(chēng)敞箱實(shí)驗(yàn)[11]，是根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境中某些行為發(fā)生的頻率和持續(xù)的時(shí)間等，來(lái)反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境中的自主行為以及以尿便次數(shù)來(lái)反映緊張度[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與高活躍組小鼠相比，低活躍組小鼠腫瘤組織重量和體積均較高，說(shuō)明具有不同行為特征的荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度不同，這也說(shuō)明穩(wěn)定的行為特征對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有影響。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫功能低下有關(guān)。社會(huì)心理因素對(duì)機(jī)體免疫力的影響主要是通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，同時(shí)這些免疫因子又作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，反饋性對(duì)心理和行為特征產(chǎn)生影響，引起心理和行為特征的改變[14]。免疫系統(tǒng)是機(jī)體主要的腫瘤防御系統(tǒng)，機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主。NK細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的自然防御細(xì)胞，又兼具重要的免疫調(diào)節(jié)功能[15]。由于NK細(xì)胞的殺傷活性無(wú)MHC限制，不依賴(lài)抗體，因此稱(chēng)為自然殺傷細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤免疫的第一道防線[16]。長(zhǎng)期壓抑的負(fù)性情緒通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)激活下丘腦，引起糖皮質(zhì)激素釋放入血。糖皮質(zhì)激素對(duì)幾乎所有免疫細(xì)胞均有影響，尤其是引起NK細(xì)胞活性下降明顯，使NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性下降，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，脾臟中含有豐富的NK細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)時(shí)易獲得，因此本研究選擇測(cè)量脾臟中NK細(xì)胞的殺傷活性來(lái)反映機(jī)體的免疫力。本研究為了探討不同行為特征對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，檢測(cè)高、低活躍兩組小鼠脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高活躍組小鼠脾臟NK細(xì)胞殺傷活性明顯較高，說(shuō)明不同行為特征肺癌模型小鼠NK細(xì)胞殺傷活性具有一定的差異性。

腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)于血管的生成，新生的腫瘤血管為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。腫瘤細(xì)胞和其間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可誘發(fā)血管進(jìn)行性生成和聚集。其中VEGF的作用是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。VEGF是較強(qiáng)的促血管生成因子，在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，原癌基因的激活和突變、抑癌基因的失活等都可導(dǎo)致VEGF的大量分泌[18]。Neufeld等[19]研究證明機(jī)體大量分泌的VEGF能特異性刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在實(shí)體腫瘤的血管生成中起著關(guān)鍵性作用。Demasi等[20]研究表明，腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移首先要有新血管的生成和構(gòu)建，否則腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的可能性都較小。Amkraut等[21]的研究結(jié)果指出不同活躍能力的大鼠其整體血管生成能力不同，低活躍大鼠的血管生成能力較高，這與本研究結(jié)果一致。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)高、低活躍組荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白的表達(dá)，通過(guò)對(duì)比VEGF蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率反映腫瘤血管生成的能力。結(jié)果顯示，與高活躍組小鼠比較，低活躍組小鼠腫瘤組織VEGF蛋白表達(dá)明顯較高，這也提示低活躍組荷瘤小鼠腫瘤血管生成能力較強(qiáng)。穩(wěn)定的行為特征與腫瘤生長(zhǎng)存在著密切的關(guān)系，這使我們將更加關(guān)注行為特征與腫瘤的關(guān)系，指導(dǎo)未來(lái)進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-11-30 本文編輯：張瑜杰）