王嬌 錢軍 石英 蔡旺喜 劉光忠

[摘要] 目的 驗證Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀HBV-DNA檢測系統(tǒng)的性能，確定該系統(tǒng)是否穩(wěn)定可靠，是否滿足臨床需求。 方法 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）頒布的EP系列文件及中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）對實驗室檢測系統(tǒng)評估的要求，對Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀進行性能評價，主要從以下幾個方面進行：精密度、正確度、線性、測量和/或可報告范圍及抗干擾能力等。結(jié)果Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀HBV-DNA檢測系統(tǒng)的批內(nèi)精密度（批內(nèi)CV）分別為5.21%（低濃度）、3.40%（高濃度）；批間精密度（批間CV）為3.45%（中值），1.39%（高值）；準(zhǔn)確度評估以參加能力驗證/室間質(zhì)評的項目來判斷，項目PT成績?yōu)?00%，通過；線性回歸方程是Y = 1.010X +0.004，R2 = 0.991線性范圍為5.00×102～2.84×108 U/mL；臨床可報告范圍為103～108 U/mL；抗干擾能力評估：檢測5個樣品中至少個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±7.5%。 結(jié)論 Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀HBV-DNA檢測系統(tǒng)具有良好的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、臨床可報告范圍、抗干擾能力，可用于臨床標(biāo)本檢測。

[關(guān)鍵詞] HBV-DNA；檢測系統(tǒng)；性能驗證

[中圖分類號] R446 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（c）-0065-04

Performance verification of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA detection system

WANG Jiao1，2 QIAN Jun1，2 SHI Ying1，2 CAI Wangxi1，2 LIU Guangzhong1，2▲

1.Department of Clinical Laboratory， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430074， China； 2.Hubei Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan 430074， China

[Abstract] Objective To verify the performance of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA detection system， in order to confirm its stability， accuracy and reliability. Methods According to the EP series of document issued by the National Committee for Clinical Laboratory Standards （NCCLS） and requirements for the assessment of laboratory testing systems issued by China National Accreditation Service for Conformity Assessment （CNAS）， the precision， accuracy， linear， measurement and/or reportable range and anti-interference ability of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR were performed and evaluated. Results The within-batch precision CV of low value and high value of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA testing system was 5.21% and 3.40%，respectively， and the between-batch precision CV of middle value and high value was 3.45% and 1.39% respectively. The correctness was valuated by participating in verification of room to judge the qualitative evaluation of the project and PT result was 100%. The linear regression equation was Y = 1.010X +0.004， R2 = 0.991. The linearity range was 5.00×102 - 2.84×108 U/mL， the clinical reportable range was 103 - 108 U/mL； five samples was tested to assess the anti-interference capability， four sample measurement results according to the concentration of expected bias was < ±7.5%. Conclusion The performance of Mx3000pTM real-time fluorescent quantitative PCR HBV-DNA testing system conforms to the requirements in precision， accuracy， linear range， clinical reportable range， anti-interference ability and can be applied to the clinical detection.

[Key words] HBV-DNA； Detection system； Performance verification

湖北省中醫(yī)院（以下簡稱“我院”）光谷分院新增分子生物學(xué)實驗室，購置一臺美國安捷倫Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀。GB/T22576-2008明確指出，臨床實驗室使用廠家已嚴(yán)格評估的檢驗方法或試劑盒之前，應(yīng)驗證相關(guān)分析性能以證實在本實驗室能達到廠家聲明的性能指標(biāo)[1]。CNAS-CL36中5.5.1.2要求定量檢測方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括正確度、精密度、線性、測量和/或可報告范圍、抗干擾能力等[2]。本文依據(jù)ISO15189[3]和原衛(wèi)生部《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》的相關(guān)文件[4]，根據(jù)HBV-DNA試劑盒產(chǎn)品性能要求，對本實驗室新購置的Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀HBV-DNA檢測系統(tǒng)進行性能驗證。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)準(zhǔn)品為武漢百泰基因工程有限公司生產(chǎn)乙肝試劑盒配套標(biāo)準(zhǔn)品（批號：20160801），質(zhì)控品由北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司提供，標(biāo)本分別為原國家衛(wèi)生計生委臨檢中心室間評價樣本，湖北省臨檢中心室間評價樣本，我院花園山院區(qū)患者檢測的樣本。

1.2 儀器與試劑

Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀（美國安捷倫公司）、生物安全柜、高速離心機、恒溫金屬浴等；武漢百泰基因工程有限公司生產(chǎn)乙型肝炎DNA定量檢測試劑盒，批號：20160801 。

1.3 方法

1.3.1 精密度的評價

每次應(yīng)進行正常的室內(nèi)質(zhì)量控制[5]，在控后方可進行精密度的評價。

1.3.1.1 重復(fù)精密度（批內(nèi)精密度） 選擇具有醫(yī)學(xué)決定水平的高低值標(biāo)本在相當(dāng)短的時間內(nèi)，按規(guī)定的操作方法，在較短時間內(nèi)及穩(wěn)定的條件下各作20次重復(fù)測定[6-7]。計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。標(biāo)本為患者血清。

1.3.1.2 中間精密度（批間精密度） 選擇室內(nèi)質(zhì)控作為衡量中間精密度的依據(jù)。選取2個月的質(zhì)控數(shù)據(jù)（濃度為中值和高值質(zhì)控品）計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。

1.3.2 正確度的評價

對衛(wèi)生部臨檢中心和湖北省臨檢中心提供的室間質(zhì)評樣本進行檢測，檢測結(jié)果與已知的 靶值和可接受限進行比對。項目PT成績≥80%，則判定通過。

1.3.3 線性范圍的評價

參照EP6-A文件[8]，用陰性血清將1.00×108濃度患者血清梯度稀釋成7份樣本，濃度分別為 1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105、1.00×104、1.00×103、1.00×102 U/mL（比廠方聲明的線性范圍低1個數(shù)量級），全部檢測應(yīng)在同一工作日內(nèi)完成。每個濃度樣本重復(fù)測定3次，記錄測定結(jié)果，計算線性相關(guān)系數(shù)和線性范圍。

1.3.4 臨床可報告范圍的評價

熒光定量PCR法HBV-DNA檢測試劑盒說明書中顯示本檢測系統(tǒng)的線性范圍分別為5.00×102～1.00×108 U/mL。該肝炎系列核酸檢測分別大于1.00×108 U/mL或1.00×107 U/mL濃度已屬臨床高載量患者，符合抗病毒治療指標(biāo)，不必對更高的載量進行精確檢測，若分別小于5.00×102 U/mL或1.00×103 U/mL已為臨床療效監(jiān)測效果較好的指標(biāo)，此群患者對抗病毒治療不敏感，因此對療效監(jiān)測意義不大。因此，當(dāng)肝炎系列核酸檢測線性范圍足夠?qū)挄r，其范圍即可成為其臨床可報告范圍。

1.3.5 抗干擾能力的評價

在不同分析物濃度血漿用高膽紅素（總膽紅素215 μmol/L）陰性血清，高血脂（三酰甘油10.5 mmol/L）陰性血清1∶1稀釋后同一時間進行檢測分析（血漿標(biāo)本及稀釋所用血清均來自通過ISO15189的湖北省中醫(yī)院花園山院區(qū)），分別檢測5個樣品，至少4個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±7.5%[2]。（參考CNAS-CL36：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》中分子診斷項目分析性能標(biāo)準(zhǔn)）。

1.4 評價標(biāo)準(zhǔn)

所有HBV-DNA濃度數(shù)據(jù)先進行以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進行統(tǒng)計學(xué)計算，計算其均值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)。

1.4.1 精密度的評價標(biāo)準(zhǔn)

檢測所有數(shù)據(jù)超出2 SD的數(shù)據(jù)不能超過2個，否則應(yīng)分析失控原因糾正后重新進行試驗。評價標(biāo)準(zhǔn)以CLIA′88規(guī)定作為允許總誤差（TEa）[9]。批內(nèi)精密度CV%應(yīng)小于1/4總允許誤差（TEa）。批間精密度CV%應(yīng)小于1/3總允許誤差（TEa）。如果批內(nèi)精密度、批間精密度小于允許范圍的，驗證通過。如果批內(nèi)精密度、批間精密度大于驗證值，精密度驗證未通過，重新驗證或與廠家聯(lián)系重新校準(zhǔn)儀器。

1.4.2 正確度的評價標(biāo)準(zhǔn)

通過檢測有證參考物質(zhì)，依據(jù)偏倚計算正確度。無有證參考物質(zhì)時，通過參加能力驗證/室間質(zhì)評來進行正確度驗證，依據(jù)偏倚計算正確度[10]。

1.4.3 線性范圍評價標(biāo)準(zhǔn)

依照CLSI的EP6-A文件的要求[11]，所有樣品應(yīng)在一次運行中或幾次間隔很短的運行中隨機測定，最好在一天之內(nèi)完成。剔除離群值，單個離群值可直接由數(shù)據(jù)組中剔除并進行重測，全部樣本無需重新測定。如發(fā)現(xiàn)多個離群值或數(shù)據(jù)點過于分散，需檢查造成此誤差的可能原因，對可能原因進行糾正后，對全部樣本進行重新測定。求出2次測定結(jié)果的平均值和每一稀釋度的預(yù)期值。

采用多項式回歸作為分析線性的評價方法，以實測均值為X，以預(yù)期值為Y，在初步判斷無離群值后，使用Excel軟件進行二元一次、二元二次和二元三次多項式的回歸分析。選擇最小標(biāo)準(zhǔn)誤差的擬合曲線為最適模型。計算最適模型在每個濃度處的預(yù)期值，其與線性模型的偏離（Dli）應(yīng)小于1/2 TEa。判斷標(biāo)準(zhǔn)：

1.4.3.1 線性1，數(shù)據(jù)擬合的最佳形式為直線，所有數(shù)據(jù)幾乎均落在一條直線上，且數(shù)據(jù)的精密度較高。該范圍為線性范圍。

1.4.3.2 線性2，數(shù)據(jù)擬合的最佳形式為非直線，但數(shù)據(jù)均在的可接受范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)擬合非線性無臨床意義。該范圍為線性范圍。

1.4.3.3 非線性，數(shù)據(jù)擬合的最佳形式為非直線，且數(shù)據(jù)超過了線性的可接受范圍，并可能有臨床意義。

1.4.3.4不精密，每份樣本的重復(fù)性差，數(shù)據(jù)有較大變異，導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)功效降低，不能用于評價線性。

如果判斷結(jié)果為非線性，則舍去最高點或最低點數(shù)據(jù)，另做回歸分析統(tǒng)計，直至出現(xiàn)線性1或線性2。如果判斷結(jié)果為不精密，則需查看檢測數(shù)據(jù)，判斷不精密的原因，并進行糾正。

1.4.4 臨床可報告范圍評價標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)肝炎系列核酸檢測線性范圍足夠?qū)挄r，其范圍即可成為其臨床可報告范圍。

1.4.5 抗干擾能力評價標(biāo)準(zhǔn)

檢測5個樣品，至少4個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±7.5%。

2 結(jié)果

2.1 HBV-DNA精密度評估結(jié)果

精密度性能驗證結(jié)果詳見表1、2。HBV-DNA低值和高值的批內(nèi)CV分別為5.21%（低濃度）、3.40%（高濃度）和中值的批間CV為3.45%（批間），小于廠家聲明的10%，CV 批內(nèi)和CV批間均符合廠家聲明。同時也滿足批內(nèi)精密度CV%小于1/4總允許誤差（TEa）（1/4×0.4=0.1），批間精密度CV%小于1/3總允許誤差（TEa）（1/3×0.4=0.13）。

表1 HBV-DNA批內(nèi)精密度評估結(jié)果

表2 HBV-DNA批間精密度評估結(jié)果

2.2 HBV-DNA正確度的評價結(jié)果

參加2016年衛(wèi)計委室間質(zhì)評和湖北省臨檢中心室間質(zhì)評，PT成績100%，驗證通過 。

2.3 線性范圍驗證結(jié)果

本研究檢測的高濃度患者標(biāo)本為2.32×108（血清來自通過ISO15189認(rèn)可的湖北省中醫(yī)院花園山院區(qū)檢驗科），對其連續(xù)10倍稀釋來進行線性范圍的驗證，得到的線性范圍是5.00×102～2.84×108 U/mL，在廠家聲明的5×102～1×108 U/mL范圍內(nèi)。見圖1 。

線性范圍為5.00×102～2.84×108 U/mL，P < 0.05

圖1 線性范圍驗證回歸曲線

2.4 臨床可報告范圍的評估

熒光定量PCR法HBVDNA檢測試劑盒說明書中顯示本檢測系統(tǒng)的線性范圍分別為5.00×102～1.00×108 U/mL。而本實驗的線性范圍驗證可檢測5.00×102～2.84×108 U/mL，該范圍足夠大，103～108 U/mL可為其的臨床可報告范圍。

2.5 抗干擾能力評估

在5個不同分析物濃度血漿中加入不同干擾物（膽紅素、三酰甘油）后進行檢測分析，分別檢測5個樣品，至少4個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±7.5%（標(biāo)準(zhǔn)參考CNAS-CL36：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》附錄A）。檢測結(jié)果見表3。

3 討論

檢測系統(tǒng)或方法學(xué)的分析性能評價是保證臨床檢驗質(zhì)量的重要內(nèi)容。ISO15189是國際 醫(yī)學(xué)界普遍承認(rèn)并遵照執(zhí)行的關(guān)于醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力方面要求的國際標(biāo)準(zhǔn)[12]。臨床實驗室在引入新的檢測系統(tǒng)或檢測方法時，多數(shù)廠家均提供了較為完整的性能參數(shù)，但需驗證其性能[13]。在臨床檢驗工作中，如果均由生產(chǎn)商進行實驗室各新儀器驗收校準(zhǔn)以及定期校準(zhǔn)，其校準(zhǔn)結(jié)果具有局限性，可信性較差[14-16]。本實驗所有患者標(biāo)本來源于我院花園山院區(qū)，我院花園山院區(qū)于2013年通過ISO15189實驗室認(rèn)可，血清標(biāo)本質(zhì)量可靠，對比性可信。本文依照依據(jù)CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）對醫(yī)學(xué)實驗室檢測系統(tǒng)性能評價的相關(guān)要求以及CNAS-CL36：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》，對我院光谷分院新購置的Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀進行性能評價，從精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、臨床可報告范圍、抗干擾因素等方面對Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀進行驗證。

精密度的檢測反映檢測結(jié)果的重復(fù)性，本實驗數(shù)據(jù)中，HBV-DNA低值和高值的批內(nèi)CV分別為5.21%、3.40%，批間CV為3.45%，小于廠家聲明的10%。準(zhǔn)確度是評價儀器測量結(jié)果與真值的一致程度。一種方案是通過檢測有證參考物質(zhì)，依據(jù)偏倚計算正確度。另一種是無有證參考物質(zhì)時，通過參加能力驗證/室間質(zhì)評來進行正確度驗證，依據(jù)偏倚計算正確度[10]。本次實驗采用第二種方案，即采用國家衛(wèi)生部臨檢中心和湖北省臨檢中心發(fā)放的室間質(zhì)評物作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，檢測了2016年全國室間質(zhì)評的5個陽性標(biāo)本，湖北省臨檢中心室間質(zhì)評5個標(biāo)本，結(jié)果全部通過，PT成績100%。線性范圍指標(biāo)本不需要任何預(yù)處理可以檢測出待測物的濃度范圍，用于線性范圍驗證的標(biāo)本應(yīng)盡覆蓋整個線性范圍[11]。廠家聲明的線性范圍為5×102～1×108 U/mL，筆者收集通過ISO15189認(rèn)可的醫(yī)學(xué)實驗室的高濃度標(biāo)本進行稀釋，檢測線性范圍為5.00×102～2.84×108 U/mL，在廠家聲明的5×102～1×108 U/mL范圍內(nèi)。當(dāng)肝炎系列核酸檢測線性范圍足夠?qū)挄r，其范圍即可成為其臨床可報告范圍。而本實驗的線性范圍驗證可檢測5.00×102～2.84×108 U/mL，該范圍足夠大，103～108 U/mL可為其的臨床可報告范圍。熒光定量PCR法HBV-DNA檢測試劑盒說明書中顯示本檢測系統(tǒng)的線性范圍分別為5×102～1×108 U/mL。該肝炎系列核酸檢測分別大于1.00×108 U/mL或1.00×107 U/mL濃度已屬臨床高載量患者，符合抗病毒治療指標(biāo)，不必要對更高的載量進行精確檢測，若分別小于5.00×102 U/mL或1.00×103 U/mL已為臨床療效監(jiān)測效果較好的指標(biāo)，此群患者對抗病毒治療不敏感，因此對療效監(jiān)測意義不大。因此，當(dāng)肝炎系列核酸檢測線性范圍足夠?qū)挄r，其范圍即可成為其臨床可報告范圍。臨床上HBV-DNA檢測時，可能的干擾因素多為黃疸或脂血，本文分別比較該兩種可能的干擾因素對結(jié)果的影響，分別檢測5個樣品，至少4個樣品測量結(jié)果與分析物預(yù)期濃度偏倚<±7.5%，表明抗干擾效果較好，可用于臨床檢測。

綜上所述，依照依據(jù)CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）對醫(yī)學(xué)實驗室檢測系統(tǒng)性能評價的相關(guān)要求以及CNAS-CL36：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》，對新購置的Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀進行性能評價，結(jié)果表明，新購置的Mx3000pTM實時熒光定量PCR儀性能和廠家聲明的一致，檢測系統(tǒng)具有良好的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、臨床可報告范圍、抗干擾能力等，符合CNAS-CL02：《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）的要求，能用于臨床標(biāo)本檢測。

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（收稿日期：2018-02-28 本文編輯：蘇 暢）