姜守剛 譚 笑 吳 磊 吳 比 袁穎潔 祖元?jiǎng)?

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

向日葵(HelianthusannuusL.)為菊科(Asteraceae)向日葵屬(Helianthus)植物，別名望日蓮、太陽花、向陽花。向日葵現(xiàn)于我國的東、西部地區(qū)和內(nèi)蒙古等地均有廣泛栽培。據(jù)文獻(xiàn)記載，向日葵的莖、葉、籽、盤、根均有治療疾病的作用[1]。向日葵莖芯為向日葵的莖內(nèi)髓芯，又名向日葵莖髓、向日葵瓤、葵花稈心、葵稈。其化學(xué)成分主要為多糖類[2]，同時(shí)也含黃酮、酚酸、不飽和脂肪酸、萜、香豆素類等。向日葵莖芯水煎液可以明顯抑制小鼠的移植瘤[3]，它還可以破壞亞硝胺，從而達(dá)到防治癌癥的目的[4]。多年以來，杭州市第二人民醫(yī)院利用向日葵莖芯煎液治療胃癌的結(jié)果表明，胃癌轉(zhuǎn)移的患者可以通過口服葵芯煎液來使病情得到有效的緩解[5]。據(jù)研究表明，向日葵的莖芯多糖能夠增強(qiáng)小鼠免疫功能[6～7]。向日葵莖芯中主要的活性成分可能是多糖。

多糖廣泛存在于自然界的植物體當(dāng)中，包括纖維素、淀粉、果膠、多聚糖等。多糖在植物的根、莖、葉、果實(shí)等組織中含量豐富[8]。多糖具有的藥理作用十分廣泛，它可以參與機(jī)體的各種生理代謝活動(dòng)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗氧化、抗病毒、降血脂、降血糖等多種生物活性[9～10]。近年來，國內(nèi)外對(duì)向日葵莖芯多糖的研究逐步增多，而對(duì)多糖提取工藝研究卻并沒有太多報(bào)導(dǎo)，向日葵莖芯多糖的提取研究頗具價(jià)值。長期以來，多數(shù)向日葵秸稈被作為取暖的燃料，或作為飼料來飼養(yǎng)家畜[11]，甚至直接被廢棄，造成極大的資源浪費(fèi)。本文采用水提醇沉法[12～13]，以向日葵莖芯為原料，提取多糖類物質(zhì)，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化向日葵莖芯多糖提取條件，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究[14]，這對(duì)向日葵資源的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

1 材料

1.1 儀器

紫外可見分光光度計(jì)(722s)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。分析天平(ALC-1104)購自北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。離心機(jī)(LG10-2.4A)購自北京京立離心機(jī)有限公司。水浴鍋(B-220)購自上海亞萊生化儀器廠。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS)購自上海亞萊生化儀器廠。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(CP-ST200A)購自長沙長錦科技有限公司。

1.2 材料與試劑

向日葵采自中國甘肅，秋季收取，將向日葵的莖芯自然晾干，再放入40℃烘箱中干燥8 h，用粉碎機(jī)將干燥的向日葵莖芯粉碎后備用。試驗(yàn)所用試劑均為分析純，測定與分析用水均為蒸餾水。無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司，無水乙醇購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。苯酚購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。氯仿購自天津市富寧精細(xì)化工有限公司。正丁醇購自天津市富寧精細(xì)化工有限公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素溶液均購自Hyclone公司。胰蛋白酶購自Gibco公司。MTT(噻唑藍(lán))購自Sigma公司。DMSO購自Solarbio公司。人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人類口腔上皮癌細(xì)胞KB均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。紫杉醇購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

2 方法

2.1 向日葵莖芯多糖的提取

取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過篩，用95%乙醇回流提取兩次，以去除脂溶性成分；再用80%乙醇回流提取兩次，以除去單糖和低聚糖[15]。所得殘?jiān)娓?，揮發(fā)去除有機(jī)溶劑后，按照一定的提取次數(shù)、原料顆粒大小(目數(shù))、料液比、提取時(shí)間、提取溫度，使用熱水浸提，待提取液冷卻后，對(duì)其進(jìn)行過濾并收集濾液。將濾液減壓濃縮至一定體積后加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量達(dá)80%，靜置24 h，3 000 r·min-1離心15 min，將所得沉淀烘干，即得到向日葵莖芯粗多糖樣品[16～17]。

2.2 向日葵莖芯多糖含量的測定

2.2.1 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚—硫酸比色法測定多糖含量，具體操作如下：以0.1 mg·mL-1無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。在8個(gè)10 mL的容量瓶中分別精密吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液，再將5.0 mL濃硫酸直接滴到溶液表面，搖勻，沸水浴加熱15 min，冷卻20 min后定容，于選定的490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，多糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16～17]。

2.2.2 多糖含量的測定

取方法2.1所得粗多糖樣品，用蒸餾水溶解后得到樣品溶液。精密吸取樣品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按2.2.1多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，于選定的490 nm波長處測定吸光度。將吸光度的數(shù)值代入上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中即可計(jì)算出樣品中的多糖濃度[16～17]。

2.3 向日葵莖芯多糖提取的單因素試驗(yàn)

選擇提取次數(shù)、原料顆粒的大小(目數(shù))、料液比(W/V)、提取時(shí)間、提取溫度作為5個(gè)單因素，考察各因素對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3.1 提取次數(shù)對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過60～80目篩，按料液比1∶50加入蒸餾水，90℃下分別浸煮提取1、2、3、4和5次，每次時(shí)間均為3.0 h。

2.3.2原料顆粒的大小(目數(shù))對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過標(biāo)準(zhǔn)樣篩的目數(shù)范圍分別為20～40、40～60、60～80、80～100以及大于100目，按料液比1∶50加入蒸餾水，90℃下分別浸煮提取2次，每次時(shí)間均為3.0 h。

2.3.3 料液比對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過60～80目篩，分別按料液比(g·mL-1)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水，90℃下浸煮提取2次，每次時(shí)間均為3.0 h。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過60～80目篩，按料液比1∶50加入蒸餾水，90℃下浸煮提取2次，每次提取時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 h。

2.3.5 提取溫度對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

準(zhǔn)確稱取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過60～80目篩，按料液比1∶50加入蒸餾水，分別于60、70、80、90和100℃下浸煮提取2次，每次時(shí)間均為3.0 h。按照2.2.2中的方法測定多糖含量。

2.4 向日葵莖芯多糖的體外抗腫瘤活性研究

采用MTT法對(duì)向日葵莖芯多糖的體外抗腫瘤活性進(jìn)行檢測。人類胃癌細(xì)胞SGC-7901、人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8、人類口腔上皮樣癌細(xì)胞KB均為貼壁細(xì)胞，用RPMI1640或DMEM培養(yǎng)液(89%基礎(chǔ)培養(yǎng)液、10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素溶液)培養(yǎng)。將100 μL的腫瘤細(xì)胞(1×104個(gè)/mL)分別鋪板至96孔板中，24 h后，分別加入空白培養(yǎng)基和向日葵莖芯多糖，各藥物分為8個(gè)濃度，即1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mg·mL-1。藥物的每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。同時(shí)陽性對(duì)照組為分別加入不同濃度的紫杉醇，陰性對(duì)照組不加藥物只加等濃度的DMSO；空白對(duì)照組只加細(xì)胞。加藥后，分別培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)，每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1)10 μL，37℃，繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄孔內(nèi)上清液，之后每孔加入100 μL DMSO，十字交叉混勻，用酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光值(OD值)。

取每4個(gè)重復(fù)孔OD值的平均數(shù)，計(jì)算細(xì)胞抑制率：

以細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)，多糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長抑制曲線，并采用Bliss法計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。試驗(yàn)重復(fù)3次。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照2.2.1的方法，以吸光度作為縱坐標(biāo)，多糖濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。將試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理得回歸方程：y=80.996x+0.009 1，其中R2=0.998 9。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定向日葵莖芯多糖樣品中的多糖濃度，并計(jì)算出多糖的含量。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of polysaccharide

3.2 向日葵莖芯多糖提取的單因素試驗(yàn)

3.2.1 提取次數(shù)對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

當(dāng)浸煮提取次數(shù)為2次時(shí)，多糖的含量較提取次數(shù)僅為1次時(shí)有所提高，隨著提取次數(shù)的增加，多糖的含量基本無明顯變化(圖2A)。綜合考慮節(jié)約時(shí)間和提取效率等因素，選擇2次為向日葵莖芯多糖最佳提取次數(shù)。

3.2.2原料顆粒的大小(目數(shù))對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

隨著目數(shù)的增加，向日葵莖芯多糖的含量逐步升高，由此可見原料直徑越小，表明細(xì)胞表面的破裂程度越大，其內(nèi)部的多糖越容易被提取出來(圖2B)。經(jīng)試驗(yàn)表明顆粒大小為60～80目的多糖含量與80目以上相差不大。因此選擇原料顆粒大小60～80目為向日葵莖芯多糖最佳提取目數(shù)。

3.2.3 料液比對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

當(dāng)料液比低于1∶50時(shí)，多糖的含量會(huì)隨料液比的增大而有所提高，當(dāng)料液比高于1∶50時(shí)，多糖含量變化并不明顯(圖2C)。當(dāng)料液比較小時(shí)，多糖不能夠提取完全；料液比過大時(shí)，后期過濾、回收、轉(zhuǎn)移較困難，會(huì)造成浪費(fèi)。因此選擇1∶50為向日葵莖芯多糖最佳提取料液比。

3.2.4 提取時(shí)間對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

當(dāng)提取時(shí)間低于3.0 h時(shí)，多糖的含量會(huì)隨提取時(shí)間的延長而有所提高，當(dāng)提取時(shí)間高于3.0 h時(shí)，多糖含量基本不隨時(shí)間的延長而增高(圖2D)。由此可知，應(yīng)選擇3.0 h為向日葵莖芯多糖的最佳提取時(shí)間。

3.2.5 提取溫度對(duì)向日葵莖芯多糖含量的影響

多糖的含量隨著溫度的升高而有所提高(圖2E)。但溫度達(dá)到90℃以上后含量幾乎無變化。分析認(rèn)為，溫度較低時(shí)，多糖浸提不充分；而過高的溫度會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有所破壞，且會(huì)影響多糖的生物活性。因此選擇90℃為向日葵莖芯多糖最佳提取溫度。

圖2 向日葵莖芯多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of the single factor test of polysaccharides extraction from Helianthus annuus L.

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，最佳提取條件為：提取次數(shù)為2次，原料顆粒的大小(目數(shù))為60～80目，料液比為1∶50，提取時(shí)間為3.0 h，提取溫度為90℃，在該條件下，向日葵莖芯多糖的提取得率為6.56%，多糖的含量為266.03 mg·g-1。

3.3 向日葵莖芯多糖的體外抗腫瘤活性研究

紫杉醇濃度分別為0.018±0.002、0.003±0.001和0.002±0.001 mg·mL-1時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和人類口腔上皮癌細(xì)胞KB的生長抑制率為50%(圖3)。向日葵莖芯多糖對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和人類口腔上皮癌細(xì)胞KB的生長均有抑制作用，且抑制率均會(huì)隨多糖濃度的增加而增加。當(dāng)向日葵莖芯多糖濃度分別為4.201±0.083、5.843±0.069和3.016±0.078 mg·mL-1時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和人類口腔上皮癌細(xì)胞KB的生長抑制率可達(dá)50%。表明向日葵莖芯多糖的體外抗腫瘤活性較弱，其抗腫瘤活性有待進(jìn)一步研究。

圖3 多糖對(duì)三種細(xì)胞作用的濃度—抑制率曲線Fig.3 The concentration-inhibition rate curve of polysaccharides exerted proliferation inhibitory activity to three tumor cell lines

4 討論

多糖具有廣泛的藥理作用，其在抗腫瘤、抗衰老、降血糖等方面都有獨(dú)特的生理活性且具有無毒、副作用小的優(yōu)點(diǎn)[18～19]。近年來，隨著多糖研究的深入，向日葵多糖的抗腫瘤活性也逐步成為熱點(diǎn)之一。向日葵資源十分豐富，其莖芯里含有豐富的多糖，之前常作為燃料、飼料或直接被丟棄而造成極大的資源浪費(fèi)。因此，對(duì)向日葵莖芯多糖的提取具有重要意義。優(yōu)化向日葵莖芯多糖的提取工藝，提高其多糖含量，對(duì)其大量提取生物活性物質(zhì)并開展生物活性的研究具有重大意義。

水提醇沉法因操作簡便，設(shè)備成本較低，能夠顯著的提高藥液澄明度等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用十分普遍[20]。影響向日葵莖芯多糖提取的因素主要有提取次數(shù)、原料顆粒的大小(目數(shù))、料液比、提取時(shí)間、提取溫度，通過單因素試驗(yàn)確定了最佳提取條件為：提取次數(shù)為2次，原料顆粒的大小(目數(shù))為60～80目，料液比為1∶50，提取時(shí)間為3.0 h，提取溫度為90℃，在該條件下，向日葵莖芯多糖的提取得率為6.56%，多糖的含量為266.03 mg·g-1。單因素試驗(yàn)優(yōu)化了向日葵莖芯多糖的提取條件，有助于提高向日葵莖芯多糖的含量，對(duì)向日葵莖芯多糖的開發(fā)利用有重要意義。

研究結(jié)果表明，當(dāng)向日葵莖芯多糖濃度分別為4.201±0.083、5.843±0.069和3.016±0.078 mg·mL-1時(shí)，對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8和人類口腔上皮癌細(xì)胞KB的生長抑制率可達(dá)50%，表明向日葵莖芯多糖的體外抗腫瘤活性較弱，可對(duì)其進(jìn)行更深入的研究和利用。