符超君　凌艷君　顏家朝

摘要：目的 觀察雙丹明目膠囊對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）大鼠視網(wǎng)膜組織低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法 SD大鼠尾靜脈一次性注射STZ（50 mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病模型，眼底熒光血管造影確認(rèn)DR模型成功。隨機(jī)分為模型組、中藥復(fù)方組和陽(yáng)性藥組，同時(shí)以正常大鼠為對(duì)照。末次給藥后，檢測(cè)大鼠血糖，觀察視網(wǎng)膜病變，Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α和NF-κB蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血糖顯著升高，視網(wǎng)膜微血管增加、熒光素滲漏明顯，HIF-1α、NF-κB蛋白和基因表達(dá)均升高；與模型組比較，中藥復(fù)方組大鼠血糖、視網(wǎng)膜微血管數(shù)量下降，熒光素滲漏面積減少，HIF-1α、NF-κB蛋白和基因表達(dá)均降低。結(jié)論 雙丹明目膠囊可有效抑制DR大鼠新血管生成，保護(hù)視網(wǎng)膜組織，其作用可能與下調(diào)視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病視網(wǎng)膜病變；雙丹明目膠囊；視網(wǎng)膜；低氧誘導(dǎo)因子-1α；核因子-κB；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.011

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）06-0044-04

Effects of Shuangdan Mingmu Capsules on Expressions of HIF-1α and NF-κB

in Retina of Diabetic Retinopathy Rats

FU Chao-jun1， LING Yan-jun2， YAN Jia-zhao1， ZHAO Hong-qing1， LV Yan1， HE Wen-long1， QIN Yu-hui1

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China；

2. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha 410006， China

Abstract： Objective To observe the effects of Shuangdan Mingmu Capsules on the expressions of HIF-1α and NF-κB； To explore its possible mechanism of treatment. Methods SD rats were injected with STZ （50 mg/kg） into the tail vein to induce diabetes mellitus. After the DR model was confirmed by fundus fluorescein angiography， the rats were randomly divided into model group， Shuangdan Mingmu Capsules group and positive medicine group， and normal rats were set as control group. After the last administration， the blood glucose level and retinopathy in rats were measured. The protein and gene expression of HIF-1α and NF-κB in the retina were detected by Western blot and RT-PCR respectively. Results Compared with control group， the blood glucose in the model group was significantly increased； the retinal capillaries increased； the leakage of fluorescein was obvious； the protein and gene expressions of HIF-1α， NF-κB were significantly increased. After administration of Shuangdan Mingmu Capsules， the model rats decreased blood glucose； retinal microvascular volume decreased； fluorescein leakage area was significantly reduced； protein and gene expressions of HIF-1α and NF-κB were decreased. Conclusion Shuangdan Mingmu Capsules can effectively inhibit the neovascularization of DR rats and protect the retina， which may be related to the down-regulation of the expressions of HIF-1α and NF-κB.

Keywords： diabetic retinopathy； Shuangdan Mingmu Capsules； retina； HIF-1α； NF-κB； rats

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率高且危害性大，是患者視力下降甚至失明的主要原因。據(jù)報(bào)道，約20%～40%糖尿病患者有不同程度的視網(wǎng)膜病變情況，且DR的發(fā)生率隨糖尿病病程的發(fā)展而明顯升高[1]。目前，DR的治療尚缺乏有效藥物，較公認(rèn)的治療藥物是羥苯磺酸鈣膠囊，但其依賴性高、不良反應(yīng)較大。雙丹明目膠囊主治肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)所致的DR，臨床應(yīng)用療效較好[2-3]。本課題組前期研究表明，雙丹明目膠囊能降低DR大鼠血糖值及血漿黏度，緩解視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)水腫、壞死情況，降低視網(wǎng)膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，保護(hù)視網(wǎng)膜組織[4-5]，但其確切機(jī)制尚不清楚。本研究在前期基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以VEGF上游因子低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）和視網(wǎng)膜上核因子-κB（NF-κB）為切入點(diǎn)，探討雙丹明目膠囊治療DR的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量220～240 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，自由攝食飲水。

1.2 藥物

雙丹明目膠囊（女貞子、墨旱蓮、三七、山萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓、紅土茯苓、牛膝、丹參、澤瀉），飲片購(gòu)于湖南上藥九旺醫(yī)藥有限公司；羥苯磺酸鈣膠囊，奧地利依比威藥品有限公司，批號(hào)170603。

1.3 主要試劑與儀器

兔抗鼠HIF-1α、NF-κB一抗（美國(guó)R&D;），STZ（美國(guó)Sigma），血糖測(cè)量?jī)x、試紙（美國(guó)Johnson），RIPA裂解液、BCA試劑盒、Trizol（美國(guó)Thermo），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢博士德），SYBR MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara），10%熒光素鈉注射液（廣州白云山）。視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)（加拿大Optoprobe），CF-600眼底照相機(jī)（日本佳能），5417R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf），電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），超微量核酸蛋白測(cè)定儀（英國(guó)BioDrop），Lightcycler 480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche）。

1.4 造模與給藥

48只SD大鼠先分為對(duì)照組（10只）和糖尿病組（38只）。糖尿病組給予高脂飼料灌胃14 d后，采用一次性尾靜脈注射STZ（50 mg/kg）建立糖尿病模型，于STZ注射72 h后測(cè)定所有大鼠空腹血糖。根據(jù)血糖測(cè)定結(jié)果，選取血糖≥16.7 mmol/L大鼠作為糖尿病模型大鼠。繼續(xù)飼養(yǎng)1周后，對(duì)所有糖尿病大鼠進(jìn)行眼底熒光血管造影，選取視網(wǎng)膜發(fā)生病變的大鼠視為DR模型成功（28只）。然后，選取27只DR大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥復(fù)方組、陽(yáng)性藥組，每組9只。中藥復(fù)方組給予雙丹明目膠囊藥液，藥物濃度為臨床等效劑量（5.6 g/kg），陽(yáng)性藥組給予羥苯磺酸鈣膠囊藥液，等效給藥濃度為5.8 mg/kg，正常組與模型組均給予等量蒸餾水，給藥體積為10 mL/kg，連續(xù)30 d。末次給藥后，所有大鼠進(jìn)行血糖測(cè)定，并選取部分大鼠再次進(jìn)行眼底熒光血管造影。檢測(cè)完成后麻醉大鼠，取右眼視網(wǎng)膜組織，4%多聚甲醛溶液保存，用于病理檢測(cè)，左眼視網(wǎng)膜組織置于液氮中凍存待用。

1.5 空腹血糖測(cè)定

測(cè)定前所有大鼠禁食6 h，采用剪尾取血法剪取大鼠尾根部動(dòng)脈血，血糖儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖。

1.6 眼底熒光血管造影

大鼠腹腔注射10%熒光素鈉（0.5 mL/kg），用托吡卡胺滴眼液散瞳后，將大鼠右眼置于眼底血管造影儀前，分開大鼠右眼眼瞼確保瞳孔充分暴露，調(diào)整儀器焦距后收集圖像，判斷大鼠眼部有無(wú)病變。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

取凍存的視網(wǎng)膜組織，加入一定量RIPA裂解液，冰上勻漿后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液制備組織蛋白提取液，BCA試劑盒法測(cè)定組織蛋白含量。按照Western blot實(shí)驗(yàn)步驟分別檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、NF-κB的蛋白表達(dá)量，根據(jù)目的蛋白和內(nèi)參蛋白對(duì)應(yīng)灰度值的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

取凍存視網(wǎng)膜組織，加一定量Trizol試劑提取組織總RNA，檢測(cè)含量合格后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增HIF-1α、NF-κB基因產(chǎn)物，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物由深圳華大基因公司合成。HIF-1α（143 bp）引物序列：上游5'-AAG TCTAGGGATGCAGCACG-3'；下游5'-AGATGGGAG CTCACGTTGTG-3'；NF-κB（148 bp）引物序列：上游5'-TGTCACTCAGGCTCTTCACCCA-3'；下游5'-TA GGCTCCCGTATGCCCTCACC-3'；β-actin（140 bp）引物序列：上游5'-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3'；下游5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用—x±s表示，組間比較用Dunnett's檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙丹明目膠囊對(duì)模型大鼠空腹血糖的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，中藥復(fù)方組大鼠空腹血糖顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1。

2.2 雙丹明目膠囊對(duì)模型大鼠眼底熒光血管造影的影響

對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管呈放射狀均勻分布，微細(xì)血管少，無(wú)熒光素滲漏；模型大鼠視網(wǎng)膜微細(xì)血管明顯增加，部分血管呈迂曲狀，可觀察到明顯的熒光素滲漏，且局部滲漏區(qū)域連接成網(wǎng)狀；中藥復(fù)方組大鼠視網(wǎng)膜微細(xì)血管數(shù)量下降，熒光素滲漏面積顯著減少，且基本只發(fā)生于微血管末梢，局部呈點(diǎn)狀排列。結(jié)果見圖2。

2.3 雙丹明目膠囊對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜低氧誘導(dǎo)因子-1α、核因子-κB蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥復(fù)方組和陽(yáng)性藥組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3。

2.4 雙丹明目膠囊對(duì)模型大鼠視網(wǎng)膜低氧誘導(dǎo)因子-1α、核因子-κB基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB基因表達(dá)均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥復(fù)方組和陽(yáng)性藥組模型大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、NF-κB基因表達(dá)均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖4。

3 討論

DR臨床多以視網(wǎng)膜微血管生成、出血、水腫、滲出等為主要特征[6]。DR中醫(yī)病機(jī)可理解為肝腎陰虛、瘀血阻絡(luò)，其中陰虛為本、腎虛為根、血瘀為標(biāo)。治療以滋陰、補(bǔ)腎、活血為基本法則，雙丹明目膠囊是基于此理法并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)成方，療效顯著。

血糖作為糖尿病的核心指標(biāo)，與DR發(fā)生率密切相關(guān)，DR多發(fā)生于長(zhǎng)時(shí)間未能有效控制血糖[7]。然而，治療DR的臨床首選藥物導(dǎo)升明無(wú)降糖效果，中藥立足于整體，能多環(huán)節(jié)、多途徑作用于疾病，改善患者依從性，增加用藥安全。本研究發(fā)現(xiàn)，雙丹明目膠囊能有效降低DR大鼠血糖，抑制微血管生成，改善微血管滲漏，進(jìn)而保護(hù)視網(wǎng)膜組織。

血管通透性增加以及新血管生成是DR發(fā)生的重要原因，血管生成刺激因子和血管生成抑制因子之間平衡的打破是微血管生成的關(guān)鍵機(jī)制[8]。研究表明，在缺血缺氧等病理狀態(tài)下，血管生成的平衡調(diào)節(jié)極易被打破，而在視網(wǎng)膜病變研究中發(fā)現(xiàn)缺氧是刺激VEGF分泌增加的重要因素[9]。HIF-1是機(jī)體低氧和缺氧的基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子，由α和β兩個(gè)亞基組成，其活性主要通過(guò)α亞基的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)。HIF-1α負(fù)責(zé)調(diào)控缺氧引起的多種細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，如血管新生、新陳代謝以及細(xì)胞凋亡等，能直接增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性，使其表達(dá)增加而誘導(dǎo)血管生成[10-11]。此外，缺氧過(guò)程又能導(dǎo)致NF-κB活化，從細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并啟動(dòng)和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞黏附分子和其他促血管生成的細(xì)胞因子（如VEGF），增強(qiáng)多形核白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)新生血管形成[12]。本研究結(jié)果顯示，DR大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB蛋白和基因表達(dá)均明顯增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；在給予雙丹明目膠囊干預(yù)后，上述趨勢(shì)得到有效逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明該藥物可降低HIF-1α、NF-κB的表達(dá)而抑制新血管生成，保護(hù)視網(wǎng)膜組織。

綜上，本研究顯示雙丹明目膠囊是通過(guò)降低DR大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB表達(dá)而發(fā)揮抑制新血管生成作用，闡明了雙丹明目膠囊保護(hù)視網(wǎng)膜組織、治療DR的部分機(jī)制，但其更深入的療效機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-01-25）

（修回日期：2018-02-06；編輯：華強(qiáng)）