龍凱花　黃昕玥　王春柳

摘要：目的 采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化丹皮酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）溫度敏感型原位凝膠的處方，并對其體外釋放性能進(jìn)行考察，為經(jīng)皮給藥制劑的研究提供參考。方法 以泊洛沙姆407和泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察因素，膠凝溫度為考察指標(biāo)，通過二項式模型及多元線性回歸模型擬合并建立膠凝溫度與2個考察因素之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，采用Box-Behnken效應(yīng)面法，對丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的處方進(jìn)行優(yōu)化，并考察該制劑的體外釋藥特性。結(jié)果 膠凝溫度與2個考察因素之間存在可信定量關(guān)系，且二項式模型較多元線性模型置信度高。丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的最佳處方為22.90%泊洛沙姆407和3.34%泊洛沙姆188，膠凝溫度為（33.4±0.1）℃，24 h內(nèi)丹皮酚NLC原位凝膠的累積釋放量為51.19%。結(jié)論 該方法適用于丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的處方優(yōu)化，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好，優(yōu)選的處方可為丹皮酚經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：溫敏型原位凝膠；丹皮酚；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法；經(jīng)皮給藥

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.018

中圖分類號：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0073-04

Optimization of Paeonol NLC Thermosensitive Gel Formulation by

Box-Behnken Response Surface Methodology

LONG Kai-hua1， HUANG Xin-yue1， WANG Chun-liu2， MU Jun3， LI Ye2

1. Xi'an Peihua University， Xi'an 710125， China； 2. Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine， Xi'an 710003， China； 3. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China

Abstrsct： Objective To optimize the formulation of paeonol nanostructured lipid carrier （NLC） thermosensitive in situ gel through Box-Behnken response surface method； To investigate its release properties in vitro to provide references for the study of transdermal drug delivery system. Methods Taking mass fraction of poloxamer 407 and poloxamer 188 as the factors， the gelling temperature as the index， the mathematical relationship between the gelling temperature and two factors was established by binomial model and multivariate linear regression model. The Box-Behnken response surface method was used to optimize the formulation of paeonol NLC thermosensitive in situ gel， and the in vitro release characteristics of the preparation was investigated. Results There was a credible quantitative relationship between the gelling temperature and the 2 factors， and the binomial model was more reliable than the multivariate linear model. The best prescriptions of paeonol NLC thermosensitive in situ gel were 22.90% poloxamer 407 and 3.34% poloxamer 188； gelling temperature was （33.4±0.1）℃， and the cumulative release amount of paeonol in situ gel in 24 h was 51.19%. Conclusion This method is suitable for the formulation optimization of paeonol NLC thermosensitive in-situ gel， and the established mathematical model has good predictability. The optimized formulation can provide references for the development of paeonol transdermal preparation.

Keywords： in situ thermosensitive gel； paeonol； nanostructured lipid carrier； central composite design - response surface method； transdermal drug delivery

丹皮酚又稱牡丹酚，主要是從蘿摩科植物徐長卿Cynanchum paniculatum（Bunge）Kitagawa的干燥根或全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹Paeonia fruticosa Andr、芍藥P.lacti flora Pall.的根皮中提取分離出來的活性成分。大量研究表明，丹皮酚具有良好的抗炎、抗過敏及抗感染作用[1-3]，但由于丹皮酚的脂溶性極強(qiáng)，生物利用度極低，具有易揮發(fā)、易氧化、生物半衰期短等缺點(diǎn)，影響其制劑的穩(wěn)定性和生物利用度[4-6]。納米給藥系統(tǒng)具有增溶難溶性藥物、提高藥物生物利用度的特點(diǎn)，能夠明顯改善藥物及制劑的突釋效應(yīng)，延長藥物作用時間，減少用藥次數(shù)，提高患者依從性。溫度敏感型原位凝膠劑作為近年來新型的外用制劑，具有易于涂抹、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[7]，局部給藥后易于吸收、不污染衣物、穩(wěn)定性好。

本研究以中藥單體丹皮酚為模型藥物，將納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體與溫度敏感型原位凝膠材料結(jié)合，以泊洛沙姆407（P407）和泊洛沙姆188（P188）為基質(zhì)，制備丹皮酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）溫敏型原位凝膠，用于經(jīng)皮給藥，采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化凝膠處方，使其在室溫時為溶液，在炎癥部位涂抹后能迅速發(fā)生相變形成凝膠，從而延長丹皮酚在皮膚表面的滯留時間，增加藥物作用時間，為經(jīng)皮給藥制劑的開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），BP211D型十萬分之一分析天平（德國賽多利斯天平有限公司），Synergy型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司），HJ-6型多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司），RC806D型溶出試驗(yàn)儀（天大天發(fā)科技有限公司）。

透析袋（截留相對分子質(zhì)量8 kDa，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度98%，批號708-9003），丹皮酚原料藥（西安天一生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%），硬脂酸（天津市紅巖試劑廠，批號2010041228B），肉豆蔻異丙酯（IPM，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號F20100420），辛酸/癸酸乙二醇甘油酯（Labrasol，法國嘉法師公司，批號201006），二乙二醇單乙基醚（Transcutol HP，法國嘉法師公司），P407（美國Sigma公司），P188（德國BASF公司），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹皮酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體溫敏型原位凝膠制備

采用微乳法制備丹皮酚NLC[8]，3%硬脂酸和3%IPM（Km=1∶1）為混合油相，18%Labrasol和6%Transtol HP為混合乳化劑（Km=3∶1），5%丹皮酚，余量用超純水補(bǔ)齊100%制成初乳液。將此處方于0 ℃條件下分散于冰水中，得到淡藍(lán)色乳光的NLC分散液。采用冷溶法制備丹皮酚溫敏型原位凝膠[9]。將制備的丹皮酚NLC置于冰箱中，4 ℃冷藏1 h，在磁力攪拌下緩慢加入P407和P188，繼續(xù)攪拌使其分散均勻，放入冰箱，4 ℃保存大于24 h，使泊洛沙姆充分溶脹，最終形成淡藍(lán)色半透明的丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠溶液。

2.2 膠凝溫度的測定

取制備好的納米粒凝膠溶液2 mL于西林瓶中，放入20 ℃水浴鍋，西林瓶內(nèi)液面低于水浴液面1 cm，緩慢升溫。每升高0.1 ℃即傾斜西林瓶45°，觀察液體流動情況，不再流動時的溫度即為凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度[10]。

2.3 處方優(yōu)化

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以膠凝溫度為考察指標(biāo)，選取P407和P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察因素，P407的取值范圍為18%～24%，P188的取值范圍為0～10%。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，膠凝溫度為因變量，每個因素5個水平，分別為±α、±1和0（α=1.414），試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表1。

2.3.2 模型擬合

采用Design-Expert8.06軟件分別對因變量與各自變量的關(guān)系進(jìn)行多元線性回歸和二項式方程擬合，分別得多元線性方程Y=88.289 71-2.680 71X1+1.308 72X2（r=0.877 9，P<0.000 1）及二項式方程Y=181.156 25-11.399 04X1+1.195 72X2+0.103 33X1X2+0.195 28X12-0.205 70X22（r=0.998 0，P<0.000 1），說明采用二項式方程擬合的效果較好。對二項式方程擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

2.3.3 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測

應(yīng)用Design-Expert8.06軟件繪制各自變量對因變量的三維效應(yīng)面和二維等高線圖，見圖1。結(jié)果顯示，當(dāng)P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變、P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時，丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠溶液的膠凝溫度呈下降趨勢；當(dāng)P407質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變、P188質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時，膠凝溫度先升高后趨于平穩(wěn)，與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。據(jù)文獻(xiàn)報道，溫敏凝膠在體外的膠凝溫度均在25～27 ℃之間[11]，但考慮到夏季高溫，凝膠在室溫下即會發(fā)生相轉(zhuǎn)變，需冷藏儲存，不便于患者用藥，因此確定膠凝溫度在32～34 ℃，得處方1（X1=22.85%，X2=3.37%）、處方2（X1=22.90%，X2=3.34%）、處方3（X1=21.39%，X2=1.97%）、處方4（X1=23.02%，X2=3.76%）、處方5（X1=23.06%，X2=4.44%）。

2.4 工藝驗(yàn)證

按上述5個處方制備丹皮酚NLC原位凝膠，平行3份，測定膠凝溫度，與預(yù)測值比較，結(jié)果見表3?？梢?，各處方的實(shí)測值與預(yù)測值差異較小。其中，處方2的實(shí)測值與預(yù)測值偏差最小，故選擇處方2進(jìn)行后續(xù)研究。

2.5 體外釋放性能考察

2.5.1 色譜條件

采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流動相為甲醇-水（70∶30），檢測波長為274 nm，進(jìn)樣量為10 ?L，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取丹皮酚對照品10.71 mg置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得214.20 ?g/mL貯備液。以透析介質(zhì)為溶劑，配制濃度分別為11.90、23.80、35.70、59.50、71.40、107.10 ?g/mL的丹皮酚對照品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=40.255X+16.950，r=0.999 8，線性范圍11.90～107.10 ?g/mL。

2.5.3 精密度考察

精密吸取高、中、低質(zhì)量濃度的丹皮酚對照品溶液適量，按“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算峰面積的RSD分別為0.5%、0.4%、0.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

取適量空白凝膠，分別精密加入高、中、低濃度（107.10、59.50、11.90 ?g/mL）的丹皮酚對照品溶液1 mL，用相應(yīng)介質(zhì)稀釋并混勻，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，按“2.5.1”項下色譜條件測定，計算回收率分別為0.98%、0.96%、0.97%，RSD分別為0.98%、0.96%、0.97%，結(jié)果見表4。

2.5.5 藥物體外釋放試驗(yàn)

分別精密量取丹皮酚原料藥、丹皮酚NLC和丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠各5 mL，置于透析袋中，將透析袋置于水浴溫度為（34±0.5）℃的生理鹽水500 mL中，轉(zhuǎn)速100 r/min磁力攪拌，每隔一定時間取樣2 mL，并補(bǔ)充等量同溫度生理鹽水[12]。按“2.5.1”項下色譜條件測定丹皮酚含量，計算累積釋放度，見圖2。結(jié)果表明，與原料藥比較，丹皮酚NLC及丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的體外釋放均較緩慢，具有明顯的緩釋效果，而丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的釋放時間延長較為明顯，24 h內(nèi)丹皮酚NLC及丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠的累積釋放度分別為59.18%和51.19%。

3 討論

為了延長丹皮酚在炎癥部位的作用時間，本試驗(yàn)采用NLC作為載體材料，制備丹皮酚納米緩釋溫度敏感型原位凝膠。原位凝膠能夠以液體狀態(tài)自由加載各種性質(zhì)的藥物，以液體狀態(tài)給藥后，在用藥部位立即發(fā)生相轉(zhuǎn)變，可有效延長藥物在用藥部位的滯留時間，具有良好的順應(yīng)性和緩控釋能力，同時可起到儲存藥物、防止藥物受環(huán)境影響等作用[13-14]。

經(jīng)處方優(yōu)化制備的丹皮酚NLC納米粒粒徑約為78 nm，較小的粒徑和P407的表面活性劑對促進(jìn)藥物的透皮性能具有協(xié)同作用，增加了P407凝膠黏度，延長了凝膠在表皮的黏附時間，并可促進(jìn)藥物的累積透皮率[15]。

本研究制備的丹皮酚NLC溫敏型原位凝膠結(jié)合了NLC與原位凝膠的優(yōu)點(diǎn)，在增加藥物溶解度的同時，在體表溫度下能夠發(fā)生相變形成凝膠，延長藥物與炎癥部位的作用時間，減少藥物流失，增加藥物的吸收。初步體外釋藥試驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚NLC原位凝膠緩釋效果良好，可進(jìn)一步延長丹皮酚的釋放時間，后續(xù)試驗(yàn)將對其體內(nèi)外透皮吸收情況進(jìn)行研究。

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（收稿日期：2017-10-25）

（修回日期：2017-11-21；編輯：陳靜）