戴永國(guó)，蔡立飛，楊 洋，韓國(guó)柱，孫慧君

(大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 臨床藥理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

隨著中國(guó)人口老齡化的日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥是中國(guó)正在面臨的重要公共健康問題之一，其特點(diǎn)是以骨量減少，骨組織顯微結(jié)構(gòu)損害，骨脆性增加，骨強(qiáng)度下降和骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為標(biāo)志的一種全身性的骨代謝障礙性疾病[1-3]?！肮侵亟ā笔蔷S持骨骼完整性的重要過程[1]。當(dāng)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收強(qiáng)于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成時(shí)，骨重建呈負(fù)平衡，造成骨丟失，產(chǎn)生以骨質(zhì)疏松為代表的病變狀態(tài)。因此，加速成骨細(xì)胞成骨分化，恢復(fù)骨重建平衡，從而改善骨質(zhì)量，對(duì)骨質(zhì)疏松的治療至關(guān)重要。三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)是一種核苷酸，在核酸的合成中具有重要作用，同時(shí)也是體內(nèi)能量的直接應(yīng)用形式以及重要的信號(hào)分子。相關(guān)研究表明，在機(jī)械負(fù)荷或組織損傷后可促進(jìn)骨細(xì)胞以自分泌或旁分泌方式釋放ATP 作為化學(xué)信使，然后可通過P2X7 受體的激活調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活性促進(jìn)成骨[4-7]。最近一些研究通過使用外源性ATP 作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)外源性ATP 同樣也可以促進(jìn)其成骨分化和礦化[8-11]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)外源性ATP 可促進(jìn)大鼠橈骨骨折愈合[12]。磷酸肌酸(phosphocreatine,PCr)是一種高能磷酸化合物，是人體和動(dòng)物體內(nèi)高能磷酸基的暫時(shí)貯存形式，是細(xì)胞能量代謝的重要物質(zhì)之一。在生命活動(dòng)中，體內(nèi)大量消耗的ATP 可快速通過肌酸激酶的作用將PCr 的磷酸基轉(zhuǎn)移到ADP 分子上生成ATP 得到補(bǔ)充。目前，外源性PCr 主要作為一種高效低毒心肌保護(hù)劑用于臨床和作為一種不違法興奮劑規(guī)定的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)劑[13-15]。然而，PCr 作為一種ATP 的補(bǔ)充劑是否可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化還未見報(bào)道。因此，本研究旨在探究PCr 是否可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化，而成為一種預(yù)防骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合的藥物，增加其臨床適應(yīng)證。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

磷酸肌酸注射用無菌粉針劑，內(nèi)含磷酸肌酸二鈉鹽四水合物，規(guī)格：1 g(按C4H8N3O5PNa2計(jì))，購于哈爾濱博萊制藥有限公司(批號(hào)：070823，純度 > 97%)。

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibico 公司)；維生素C、MTT、TritonX-100(Amresco 公司)；0.2%茜素紅S 染色液、β-甘油磷酸鈉(Solarbio 公司)； 堿性磷酸酶(ALP)活性分析試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA 試劑盒、GAPDH抗體、ECL 顯色試劑盒、Western及IP裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；ALP、BMP-2 抗體(中國(guó)武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 二抗(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

二氧化碳孵育箱(Thermo 公司)；倒置顯微鏡TS100(日本Nikon 公司)；Air Tech 超凈工作臺(tái)(博訊實(shí)業(yè)有限公司)；Thermo 354 酶標(biāo)儀和低溫超速離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)；MLS-3750 高壓滅菌器(日本Sanyo 公司)；PS 9 型半干式轉(zhuǎn)移電泳儀和垂直電泳儀(大連競(jìng)邁有限公司)；Amersham Imager 600 凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

MC3T3-E1 細(xì)胞株購于中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞用含10 % 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培液(培養(yǎng)基中加入100 U·mL-1的青霉素、100 U·mL-1的鏈霉素)，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔1 d 更換一次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用含10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉和50 mg·L-1維生素C 的培養(yǎng)液來作為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(Control組)、PCr低劑量組、PCr中劑量組、PCr高劑量組。Control組不給予PCr藥物處理；PCr低、中、高劑量組分別給予5、10、20 mmol·L-1的PCr進(jìn)行藥物處理。

1.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將MC3T3-E1 細(xì)胞以1×105· mL-1的細(xì)胞密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 洗滌細(xì)胞，加入含有PCr(5,10,20 mmol·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h、24 h 和48 h，之后通過MTT 法測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。向每個(gè)孔中加入10 μL MTT 溶液(5 mg·mL-1)，然后繼續(xù)孵育4 h。 孵育4 h 后，除去MTT 溶液，之后加入三聯(lián)液，每孔100 μL，孵育過夜。用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 的OD570 值。

1.5 ALP活性的測(cè)定

PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性影響的實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行給藥后測(cè)定。MC3T3-E1 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液，繼續(xù)在體積分?jǐn)?shù)為5 % CO2、37 ℃ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每天換液1次。然后棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液，加入含有不同濃度PCr(5,10,20 mmol·L-1)的培養(yǎng)液處理24 h 后測(cè)定ALP活性，即：將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗2 次后，用0.2% Triton X-100 裂解細(xì)胞20 min，收集裂解液于1.5 mL EP管中，4 ℃、14000 g 離心10 min，取上清液。用堿性磷酸酶(ALP)活性分析試劑盒測(cè)定ALP含量，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白總含量，按照堿性磷酸酶(ALP)活性分析試劑盒說明中提供的公式計(jì)算單位蛋白中ALP 的含量。

1.6 Western Blot 檢測(cè)ALP、BMP-2 蛋白表達(dá)情況

MC3T3-E1 細(xì)胞接種在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)PCr(5,10,20 mmol·L-1)處理24 h 后，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞全蛋白，然后用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白總含量，調(diào)節(jié)各組蛋白至同一濃度。在定量好的蛋白內(nèi)加入等體積的2×loading buffer，100 ℃ 變性5 min，然后，將制備好的蛋白樣品置-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE 電泳時(shí)，各組取20 μg 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，經(jīng)電泳分離后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉在37 ℃ 水浴中封閉2 h，然后分別加入GAPDH、BMP-2、ALP 的一抗，4 ℃ 過夜；次日TBST 洗膜(3 次，每次10 min)后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(或抗鼠)IgG 二抗，室溫孵育2 h；然后經(jīng)TBST 洗膜(3 次，每次10 min)后，用ECL 顯色液將膜顯色之后置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照，分析蛋白條帶光密度值。

1.7 茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)

陽性茜素紅染色是一種常見的組織化學(xué)技術(shù)，用于檢測(cè)礦化組織和培養(yǎng)細(xì)胞中的鈣沉積。本研究采用茜素紅染色觀察MC3T3-E1 細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)形成情況。將MC3T3-E1 細(xì)胞接種在12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)成細(xì)胞單層后，棄去原培養(yǎng)液，加入不同濃度的PCr 藥液(5,10,20 mmol·L-1)處理24 h后，用礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液處理28 d。然后，將MC3T3-E1 細(xì)胞用PBS 洗滌后，在95%的乙醇中固定15 min，雙蒸水漂洗，用0.2%茜素紅S(pH8.3)染色45 min，再用PBS漂洗細(xì)胞以減少非特異性染色。最后，低倍顯微鏡下(×4)視野下觀察，深紅色的陽性染色結(jié)節(jié)為形成的礦化結(jié)節(jié)，并隨機(jī)選取6個(gè)視野，記錄礦化結(jié)節(jié)數(shù)目，倒置顯微鏡照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響

MTT 法檢測(cè)PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖的影響的結(jié)果顯示：與Control 組相比，當(dāng)PCr (5,10,20 mmol·L-1)作用12 h 后，PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞無促增殖作用(P>0.05)；作用24 h 后，10 mmol·L-1的PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞有一定的促增殖作用(P<0.05)，見表1；而5 和20 mmol·L-1的PCr 無顯著增殖作用(P>0.05) ；作用48 h后，各濃度的PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞均具有顯著的促增殖作用(P<0.01)，分別達(dá)到137%、146%、153%。見表1。

組別OD57012 h24 h48 hControl組 0.428±0.069 0.437±0.040 0.984±0.134PCr(5 mmol·L-1)組 0.424±0.065 0.550±0.037 1.346±0.0972)PCr(10 mmol·L-1)組 0.414±0.030 0.594±0.0311) 1.438±0.1292)PCr(20 mmol·L-1)組 0.417±0.021 0.569±0.023 1.504±0.0552)

與Control 組相比，1)P<0.05；2)P<0.01

2.2 PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性以及ALP 和BMP-2 蛋白表達(dá)的影響

堿性磷酸酶(ALP)活性分析試劑盒檢測(cè)ALP 的活性，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，MC3T3-E1 細(xì)胞在PCr 處理后，10和20 mmol·L-1的PCr 可使ALP 的活性提高1.37和2.14倍(P<0.05,P<0.01)，見圖1A。同時(shí)，通過Western Blot 檢測(cè)ALP 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與Control組比較，5 mmol·L-1的PCr對(duì)ALP 蛋白的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)，而當(dāng)PCr濃度為10和20 mmol·L-1時(shí)可以明顯上調(diào)ALP 蛋白的表達(dá)水平(P<0.01,P<0.01)，見圖1B。

Western Blot 檢測(cè)BMP-2 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與Control組比較，PCr(5、10和20 mmol·L-1)可以明顯上調(diào)BMP-2 蛋白的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，見圖1C。

A: ALP 活性; B: ALP 蛋白表達(dá)；C: BMP-2 蛋白表達(dá)。與Control組相比，*P<0.05,**P<0.01圖1 PCr 對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP 活性以及ALP和BMP-2蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Effect of PCr on ALP Activity,ALP and BMP-2 expression in MC3T3-E1 cells

2.3 PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響

茜素紅染色后，細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)被染成深紅色，可以通過顯微鏡進(jìn)行觀察，見圖2A。結(jié)果顯示：與對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)數(shù)(7±3)個(gè)相比，PCr濃度為5、10和20 mmol·L-1組中的礦化結(jié)節(jié)數(shù)顯著地增加，數(shù)量分別達(dá)到(17±5)個(gè)、(20±3)個(gè)、(31±5)個(gè)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01,P<0.001)，見圖2B。

A:細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色，比例尺：200 μm，箭頭示礦化結(jié)節(jié)；B:各組礦化結(jié)節(jié)數(shù)統(tǒng)計(jì)。與Control 組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001圖2 PCr 對(duì)MC3T3-E1 細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的影響Fig 2 Effect of PCr on the formation of mineralized nodules in MC3T3-E1 cells

3 討 論

外源性PCr 是在短期和長(zhǎng)期使用時(shí)均無潛在毒性的高能磷酸化合物，目前主要用于：(1)醫(yī)療用途——用于心臟問題，營(yíng)養(yǎng)心肌、改善心肌代謝[13,15]；(2)體育用途——用于提高肌肉力量、補(bǔ)充能量[14]。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，外源性PCr 肌注或靜脈給藥后，可很快使血液中ATP 水平升高。因此，外源性PCr 是一種補(bǔ)充體內(nèi)ATP 水平的低毒藥物。近年來有關(guān)研究表明，外源性ATP 具有促進(jìn)成骨的作用和促進(jìn)骨折愈合的作用：(1)它可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的成骨分化與礦化[8-11]；(2)它可促進(jìn)大鼠橈骨骨折愈合[12]。于是，猜測(cè)外源性PCr 可能也有潛在的促進(jìn)成骨的作用。

在骨生長(zhǎng)發(fā)育過程中，骨重建平衡對(duì)于維持骨骼健康起到了很重要的作用[1]。當(dāng)骨重建呈負(fù)平衡時(shí)(即：骨吸收強(qiáng)于骨形成時(shí))，發(fā)生骨丟失，產(chǎn)生以骨質(zhì)疏松為代表的病變。骨重建是多個(gè)基本細(xì)胞單位(包括成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞)參與完成的一系列復(fù)雜的代謝過程。其中成骨細(xì)胞與骨形成關(guān)系最為密切，是成骨的決定因素。在骨形成過程中，成骨細(xì)胞需要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分化與成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化等階段成骨[17-18]。MC3T3-E1細(xì)胞系具有極好的成骨分化潛能，是體外研究骨細(xì)胞增殖、分化與礦化的細(xì)胞模型。所以，本研究將PCr 作用于體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞，通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)來研究并確認(rèn)PCr 對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化與礦化等方面的影響。

在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，細(xì)胞增殖與細(xì)胞分化是兩個(gè)重要的方面。在成骨細(xì)胞增殖期間，成骨細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)大幅度增加，為最終成骨細(xì)胞礦化做準(zhǔn)備。本研究中采用MTT 法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示：濃度為5、10 和20 mmol·L-1的PCr 可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖。在增殖晚期，成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞開始進(jìn)入分化期。在分化階段，成骨細(xì)胞可通過合成與分泌各種物質(zhì)來參與骨代謝，如：ALP、BMP-2、OCN、Runx-2 等。其中，ALP 是成骨分化的一個(gè)早期特異性指標(biāo)[19-20]。它是一種能將底物去磷酸化的酶，可分解體內(nèi)細(xì)胞和組織中的有機(jī)磷，調(diào)節(jié)磷酸鹽(Pi)和焦磷酸鹽(PPi)的比率，調(diào)節(jié)羥磷灰石的形成，為最終骨組織的礦化提供條件。ALP 的活性可在成骨細(xì)胞分化過程中代表細(xì)胞分化的水平。BMP-2是目前所知的誘導(dǎo)和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化能力最強(qiáng)的物質(zhì)之一，可增加ALP、OCN 和Runx-2 等骨標(biāo)志物的表達(dá)，與之一起誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化[21-23]。成骨細(xì)胞進(jìn)入分化晚期時(shí)，細(xì)胞開始礦化，形成礦化結(jié)節(jié)。礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨細(xì)胞分化成熟的晚期標(biāo)志，標(biāo)志著進(jìn)入具有成骨功能階段[24]。因此，在本研究中，用堿性磷酸酶(ALP)活性分析試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP 的活性、用Western Blot法檢測(cè)ALP和BMP-2 的蛋白表達(dá)情況以及用茜素紅染色法從形態(tài)學(xué)上檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞礦化的能力，評(píng)價(jià)PCr 對(duì)成骨細(xì)胞的成骨分化與礦化的影響。結(jié)果顯示：PCr 可以升高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的ALP的活性和蛋白表達(dá)、BMP-2的蛋白表達(dá)以及增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)，即PCr 具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化與礦化的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PCr 具有促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化與礦化的能力，表明PCr 能夠促進(jìn)成骨，這預(yù)示PCr 在將來有可能成為一種預(yù)防骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合的藥物而用于臨床。本研究只是對(duì)PCr 在促進(jìn)成骨方面的初步探究，若要解釋其促成骨的具體相關(guān)作用機(jī)制，還需要進(jìn)行大量深入研究。