郭偉兵，李文君，段 姣，陳春龍，胡玉萍，劉清珍，張利東，李偉彥

0 引 言

疼痛是現(xiàn)代人類健康和社會發(fā)展的主要問題之一，困擾全球數(shù)以億計的人群。阿片類藥物在治療諸多形式的疼痛過程中應(yīng)用廣泛。但在肌肉和內(nèi)臟引起的深部痛的治療過程中發(fā)現(xiàn)嗎啡并不能提供充分的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而且μ受體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用會產(chǎn)生很多副作用，如欣快感、呼吸抑制以及惡心等[1]。而羥考酮是一種μ、κ阿片受體激動劑，與單純μ受體激動劑嗎啡的藥理效應(yīng)不同。臨床上也觀察到羥考酮在治療疼痛中比嗎啡可能具有更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，有文獻(xiàn)[2]報道，羥考酮與嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)在不同組織也不一致，在皮膚和肌肉部位的疼痛，鎮(zhèn)痛效應(yīng)是等效的，而對在食道部位的熱和機(jī)械刺激引起的疼痛，羥考酮則比嗎啡具有更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果，可能與κ阿片受體有關(guān)。而羥考酮在對內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中，κ、μ阿片受體各自的占比仍不清楚。因此本文擬探討羥考酮與嗎啡在內(nèi)臟痛及炎性痛疼痛模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異，研究羥考酮在不同疼痛模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異中與κ受體的結(jié)合能力的關(guān)系，并初步探討羥考酮對內(nèi)臟痛發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的κ、μ阿片受體各自占比。

1 材料與方法

1.1藥品和試劑鹽酸羥考酮注射液(oxycodone，Oxy)由Hamol Limited有限公司生產(chǎn)；鹽酸嗎啡注射液(morphine,Mor)由東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司生產(chǎn)；冰醋酸溶液由成都市新都區(qū)化工試劑廠生產(chǎn)；甲醛注射液由西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；選擇性μ受體拮抗劑naloxonazine購于Sigma公司；選擇性κ受體拮抗劑nor-binhorphimine(Nor-BIN)購于Abcam公司。這6種藥物均用等滲鹽水溶解或稀釋，等滲鹽水由石家莊四藥有限公司生產(chǎn)。

1.2動物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠360只，體重200～250 g,清潔級，由南京軍區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號：scxk(軍)2012-0014；使用許可證號:syxk(軍)2012-0047。實驗室光照時間6：00-18：00，溫度控制在18～22 ℃，在安靜環(huán)境中進(jìn)行行為學(xué)觀察。為減少生物節(jié)律對動物行為的影響，實驗時間為每日9：00-12：00，實驗前動物不禁飲食。

1.3實驗方法SD大鼠360只，在實驗開始前均先放入觀察箱中適應(yīng)30 min。觀察者、指標(biāo)統(tǒng)計者均不知相應(yīng)分組情況。

1.3.12%醋酸扭體模型其中156只SD大鼠以腹腔注射化學(xué)物質(zhì)引起的大鼠扭體反應(yīng)作為內(nèi)臟痛的實驗?zāi)Ｐ?。隨機(jī)均分為13組，分別為內(nèi)臟痛對照組，羥考酮(0.4、0.64、1.0、1.6、2.6、4.2 mg/kg)組；嗎啡(0.4、0.64、1.0、1.6、2.6、4.2 mg/kg)組。上述藥物均用生理鹽水進(jìn)行配置，分別將上述藥液經(jīng)右側(cè)腹壁注入腹腔，其中對照組注射等量等滲鹽水。注藥后15 min，將等滲鹽水稀釋的2%冰醋酸以4 mL/kg經(jīng)另一側(cè)腹壁注入腹腔，然后立即放入觀察箱中觀察(開始計時)，以腹部內(nèi)凹伴后肢伸展計為扭體1次，計數(shù)每5 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)，作為內(nèi)臟痛程度的定量指標(biāo)，計算60 min內(nèi)扭體總數(shù)，并根據(jù)各組扭體平均次數(shù)計算扭體反應(yīng)的抑制率。根據(jù)扭體抑制率分別計算羥考酮及嗎啡在2%醋酸扭體模型中的半數(shù)有效量(50% effective dose, ED50)。扭體反應(yīng)的抑制率計算公式如下：

扭體反應(yīng)的抑制率=(對照組平均扭體次數(shù)-試驗組平均扭體次數(shù))/對照組平均扭體次數(shù)×100%

1.3.25%甲醛炎性痛模型將180只SD大鼠以左足底注射5%甲醛作為炎性痛模型，隨機(jī)分為15組，分別為炎性痛對照組，羥考酮(0.6、0.96、1.54、2.46、3.9、6.3、10.0 mg/kg)組；嗎啡(0.6、0.96、1.54、2.46、3.9、6.3、10.0 mg/kg)組。甲醛實驗在30 cm×30 cm×30 cm有機(jī)玻璃籠中進(jìn)行，分別將上述藥液經(jīng)右側(cè)腹壁注入腹腔，其中對照組注射等量等滲鹽水。注藥后15 min，參照Zhang等[3]方法，使用30G注射器于大鼠左后爪掌側(cè)皮下注射5%甲醛50 uL后立即放入觀察箱中,箱下放置與地面成45°角的鏡子以便觀察。注射后1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min進(jìn)行甲醛疼痛評分[4]：0分為注射爪可正常承重并自由活動，1分為注射爪可接觸地面但不能承重，2分為注射爪不能接觸地面,3分為大鼠舔咬注射爪。本研究根據(jù)權(quán)重評分法[4]計算每個觀察時間點(diǎn)的甲醛疼痛評分(PIR)作為炎性痛程度的定量指標(biāo)。PIR=(1*T1+2*T2+3*T3)/60，T1、T2、T3分別為出現(xiàn)評分為1、2、3分行為學(xué)表現(xiàn)的持續(xù)時間。其中以0～5 min為Ⅰ相，15～60 min為Ⅱ相[4]。根據(jù)Ⅰ相、Ⅱ相中甲醛疼痛評分，分別計算Ⅰ相、Ⅱ相的甲醛疼痛抑制率。根據(jù)甲醛疼痛抑制率分別計算羥考酮及嗎啡在5%甲醛炎性痛模型中的ED50。甲醛疼痛抑制率計算公式如下：

甲醛疼痛抑制率=(對照組平均甲醛疼痛評分-試驗組平均甲醛疼痛評分)/對照組平均甲醛疼痛評分×100%

1.3.3羥考酮在內(nèi)臟痛模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中κ、μ受體的比例測定根據(jù)羥考酮在2%醋酸扭體模型中所測出的ED50值，將24只SD大鼠隨機(jī)均分為4組，繼續(xù)使用2%醋酸扭體模型，分對照組(D組)、羥考酮ED50組(E組)、κ受體拮抗劑Nor-BNI 20 mg/kg+羥考酮ED50組(K組)、μ受體拮抗劑naloxonazlne 20 mg/kg+羥考酮ED50組(U組)，計算扭體次數(shù)及扭體抑制率。將上述各組藥液經(jīng)右側(cè)腹壁注入腹腔，其中D組注射等量等滲鹽水。注藥后15 min，將等滲鹽水稀釋的2%冰醋酸以4 mL/kg經(jīng)另一側(cè)腹壁注入腹腔，然后立即放入觀察箱中觀察(開始計時)，觀察扭體次數(shù)。其中κ受體拮抗劑Nor-BNI、μ受體拮抗劑naloxonazlne的劑量均通過預(yù)實驗得出繼續(xù)增加劑量后扭體次數(shù)不再增加，從而確定為最佳給藥劑量，分別得出給藥劑量為Nor-BNI 20 mg/kg，naloxonazine 20 mg/kg,于試驗前24 h經(jīng)皮下給藥[5]。得出羥考酮在2%醋酸扭體模型發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)的κ、μ受體所占的比例。

2 結(jié) 果

2.1腹腔注射羥考酮與嗎啡在2%醋酸扭體模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與對照組相比，腹腔注射各濃度嗎啡及羥考酮組60 min內(nèi)扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。羥考酮ED50為0.6602 mg/kg(95%CI=0.02712～16.07 mg/kg)、嗎啡為1.942 mg/kg(95%CI=0.2773～13.60 mg/kg)，羥考酮ED50/嗎啡ED50約為1∶2.94。見圖1。

2.2羥考酮與嗎啡在5%甲醛炎性痛模型中的ED50與對照組比較，Ⅰ相及Ⅱ相中腹腔注射各濃度嗎啡組及羥考酮組在60 min內(nèi)舔足抬腿評分減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中Ⅰ相中羥考酮ED50為1.921 mg/kg(95%CI：1.199～3.077 mg/kg)、嗎啡ED50為4.484 mg/kg(95%CI：1.797～11.19 mg/kg)，羥考酮ED50/嗎啡ED50比值約為1∶2.334；Ⅱ相羥考酮ED50為2.262 mg/kg(95%CI=1.378～3.715 mg/kg)、嗎啡ED50為3.812 mg/kg(95%CI：1.769～8.213 mg/kg)，羥考酮ED50/嗎啡ED50比值約為1∶1.69。見圖2、圖3。

2.3羥考酮在2%醋酸扭體模型中κ、μ受體的鎮(zhèn)痛效應(yīng)D組在2%醋酸扭體模型中的扭體次數(shù)為(45.8±2.5)次，E組為(22.5±2.4)次，K組為(37.8±1.7)次, U組為(26.8±2.1)次。與D組比較，各組扭體次數(shù)減少(P<0.05)。在2%醋酸扭體內(nèi)臟痛模型中，羥考酮發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的κ受體與μ受體的比例約為2.375∶1。

a:嗎啡的劑量-效應(yīng)曲線；b：羥考酮的劑量-效應(yīng)曲線；c:嗎啡的log(劑量)-效應(yīng)曲線；d:羥考酮的log(劑量)-效應(yīng)曲線與對照組相比，*P<0.05，n=12圖1 羥考酮及嗎啡在2%醋酸扭體模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線

a：嗎啡的劑量效應(yīng)曲線；b：羥考酮的劑量效應(yīng)曲線；c：嗎啡的log(劑量)-效應(yīng)曲線；d：羥考酮的log(劑量)-效應(yīng)曲線與對照組相比，*P<0.05,n=12圖2 羥考酮與嗎啡在5%甲醛炎性痛模型I相中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線

a：嗎啡的劑量效應(yīng)曲線；b：羥考酮的劑量效應(yīng)曲線；c：嗎啡的log(劑量)-效應(yīng)曲線；d：羥考酮的log(劑量)-效應(yīng)曲線與對照組相比，*P<0.05,n=12圖3 羥考酮與嗎啡在5%甲醛炎性痛模型Ⅱ相中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線

3 討 論

內(nèi)臟痛的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，同一部位的疼痛可能包含有多個內(nèi)臟器官的痛覺信號，且內(nèi)臟損傷程度與疼痛強(qiáng)度無確切聯(lián)系，目前，內(nèi)臟痛的傷害性刺激可分為機(jī)械性刺激、化學(xué)性刺激、缺血性刺激、電刺激、心理應(yīng)激及溫度刺激等，通過這些傷害性刺激引起內(nèi)臟的傷害性反應(yīng)從而建立起內(nèi)臟痛模型。扭體反應(yīng)模型作為經(jīng)典的內(nèi)臟痛實驗?zāi)Ｐ?，是通過腹腔注射乙酸、硫酸鎂、乙酰膽堿、緩激肽等刺激壁層腹膜和腹腔臟器產(chǎn)生以體腔壁痛為主的內(nèi)臟痛，引起弓背、腹部肌肉收縮、后肢伸展的行為改變。本研究通過預(yù)實驗及參考姚明等[6]方法選擇以2%醋酸腹腔注射作為內(nèi)臟痛模型，劑量選擇4 mL/kg均可出現(xiàn)扭體反應(yīng)，且較為穩(wěn)定，60 min內(nèi)扭體次數(shù)大約為45次，之后基本不出現(xiàn)扭體。大鼠甲醛模型是急性組織損傷介導(dǎo)疼痛的經(jīng)典試驗?zāi)Ｐ蚚4]，通過足底注射甲醛后可出現(xiàn)雙相疼痛行為改變，第一相疼痛的產(chǎn)生是炎性物質(zhì)直接刺激傷害性感受器，產(chǎn)生傷害性刺激傳導(dǎo)至中樞形成痛覺；而第二相反應(yīng)的產(chǎn)生是因為肥大細(xì)胞釋放組胺等炎性介質(zhì)的外周機(jī)制使得中樞發(fā)生敏化而產(chǎn)生[7]，所以本文將5%甲醛50 μL足底掌側(cè)注射作為炎性痛模型。本研究使用此上述兩種實驗?zāi)Ｐ吞接懓⑵愃幬镌趦?nèi)臟痛、炎性痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并探討羥考酮在內(nèi)臟痛模型中發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)時κ受體與μ受體的占比。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔給以嗎啡及羥考酮均可呈劑量依賴性發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其中羥考酮ED50/嗎啡ED50的比值在甲醛模型的Ⅰ相、Ⅱ相分別為1∶2.334、1∶1.69，而在醋酸扭體模型中為1∶2.94，即相較于炎性痛模型，羥考酮與嗎啡的比值在內(nèi)臟痛模型中較小，提示相較于炎性痛，羥考酮在內(nèi)臟痛中可能具有更加優(yōu)越的鎮(zhèn)痛效果。有研究[8]認(rèn)為，外周效應(yīng)的不同可能在兩種藥物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)中起到了重要作用。有研究[9]證實相同劑量的嗎啡腹腔給藥后可降低內(nèi)臟痛模型的扭體次數(shù)，而靜脈給藥則沒有任何鎮(zhèn)痛作用，表明嗎啡經(jīng)腹腔給藥時可能是通過外周效應(yīng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)。而羥考酮作為半合成的阿片類藥物，通過激動κ受體、μ受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，且可通過主動運(yùn)輸跨越血腦屏障，發(fā)揮中樞性鎮(zhèn)痛效應(yīng)，有研究[10]發(fā)現(xiàn)，在甩尾試驗和熱板試驗大鼠模型中，經(jīng)鞘內(nèi)給藥后嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)為羥考酮的14倍，但經(jīng)皮下和腹腔給藥時羥考酮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)為嗎啡的2～4倍，可能與羥考酮的外周效應(yīng)有關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肺、消化道等外周器官中均有阿片受體分布，是阿片藥物發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的一個重要靶點(diǎn)，而且在炎癥環(huán)境中，外周傳入神經(jīng)纖維末梢以κ受體為主的阿片受體表達(dá)增加[11]，因此羥考酮發(fā)揮鎮(zhèn)痛的作用增強(qiáng)。Simonin等[12]發(fā)現(xiàn)，在醋酸扭體模型中，敲除κ受體基因的小鼠疼痛反應(yīng)更劇烈，即對內(nèi)臟痛更加敏感，使用κ受體激動劑可減輕疼痛反應(yīng)，而μ受體基因敲除的小鼠對于熱痛刺激更加敏感，提示κ受體對于內(nèi)臟痛的形成至關(guān)重要。有研究使用低頻振蕩振幅算法靜息態(tài)功能磁共振發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)臟痛形成的相關(guān)腦區(qū)活動異常[13]，而另有研究發(fā)現(xiàn)κ受體也廣泛存在相關(guān)腦區(qū)中,提示κ受體在中樞效應(yīng)中對內(nèi)臟痛的形成也必不可少,具體機(jī)制仍有待探討[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在以醋酸等化學(xué)物質(zhì)引起的內(nèi)臟痛及甲醛引的炎性痛中，羥考酮的鎮(zhèn)痛作用均強(qiáng)于嗎啡，且對于內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)更強(qiáng)，可能與此有關(guān)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

羥考酮發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)時κ受體、μ受體各自的占比仍不清楚，本研究初步探討在2%醋酸扭體模型中兩者的比例，通過前期預(yù)實驗得出κ受體、μ受體特異性拮抗劑的最佳給藥劑量，通過得出的羥考酮ED50給藥，計算扭體次數(shù)，初步估計κ受體、μ受體兩者的比例為2.375∶1，提示在醋酸扭體模型中，羥考酮主要通過κ受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，可能與內(nèi)臟痛中κ受體起主要鎮(zhèn)痛作用有關(guān)[9]。

綜上所述，羥考酮及嗎啡在內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)的差異可能與阿片受體的外周效應(yīng)有關(guān)，本文也初步探討了羥考酮在內(nèi)臟痛模型發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用時的κ、μ受體各自的占比，但在內(nèi)臟初級傳入神經(jīng)纖維末梢的μ、κ受體具體激活以及調(diào)控的分子機(jī)制方面，尚需進(jìn)一步研究。