夏 楊，蘇初連，晁 駿，康 浩，蒲金基，2，張 賀*

(1 海南大學 熱帶農(nóng)林學院，?？?570228；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所，?？?71101)

VOZ(vascular plant one-zinc finger protein)即維管植物鋅指蛋白，它是一類廣泛存在于植物中的轉錄因子，與植物的進化和發(fā)育密切相關。在擬南芥中，VOZ轉錄因子家族包含2個成員，分別稱為AtVOZ1和AtVOZ2，AtVOZ1和AtVOZ2的同源物被發(fā)現(xiàn)存在于各種維管植物以及小立碗蘚中[1]，它們能與V-PPase(Vacuolepyrophosphatase)AVP1啟動子中的38 bp順式作用區(qū)域結合[2]，AtVOZ1在韌皮部組織中特異性表達，而AtVOZ2在根部強烈表達。研究表明，擬南芥的AtVOZ1和AtVOZ2轉錄因子能調節(jié)從營養(yǎng)生長到開花的過渡，Atvoz1Atvoz2雙突變體在長日照條件下表現(xiàn)出推遲開花的表型[3]。在水稻中，OsVOZ1受包括干旱、低溫、高溫、高鹽等在內的多種逆境的誘導表達，而且在不同的組織中，該基因的表達也存在明顯的差異，在莖和葉中的表達要明顯高于根中。與此同時，還發(fā)現(xiàn)該基因過量表達的轉基因株系對高鹽有一定的表型[4]。在齒肋赤蘚中，ScVOZ1具有轉錄調控功能和核定位潛力，且與AtVOZ1具有高度的相似性[5]。

菠蘿 (Ananascomosus)屬鳳梨科鳳梨屬，原名鳳梨。原產(chǎn)美洲熱帶和亞熱帶，性喜溫暖，最適生長的年均氣溫為24～27 ℃。15 ℃以下生長緩慢，5 ℃是受凍的臨界溫度，43 ℃高溫即停止生長。性耐旱，需一定水分，年降雨量需1 000～1 500 mm且分布均勻為宜。中國是菠蘿十大主產(chǎn)國之一，主要種植在廣東、海南、廣西、福建、云南等省[6]。近年來，在許多地區(qū)，干旱和鹽漬化面積迅速擴張，估計到2050年將有50%可耕地面積嚴重鹽漬化[7]。干旱、鹽堿、極端溫度等非生物脅迫能夠對植物的生長發(fā)育造成嚴重的危害[8]，導致產(chǎn)量下降，是引起全球糧食作物減產(chǎn)的首要原因[9]。諸如干旱、鹽堿、極端溫度等非生物脅迫嚴重危害著菠蘿生產(chǎn)，進而制約菠蘿產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，因而有必要運用現(xiàn)代分子生物學技術開展菠蘿的花果調控、抗旱耐寒性新品種選育。

1 材料和方法

1.1 菠蘿非生物脅迫處理

將株高約10 cm均勻一致的菠蘿組培苗，移栽于花盆中，置于25 ℃溫室中，以相對濕度約80%、14 h光照/10 h黑暗光周期下進行脅迫處理，每個處理10株組培苗，以0 h處理為對照。

以300 mmol/L NaCl溶液、20%PEG6000溶液、200 mmol/L甘露醇溶液、100 mmol/L雙氧水(H2O2)溶液分別淋灌菠蘿組培苗，干旱處理以菠蘿組培苗自然失水6%時、移植缺水基質后，分別于0、12、24、48、72、96和120 h取樣；以15 mmol/L乙烯利(Eth)溶液、0.5 mmol/L水楊酸(SA)溶液、0.5 mmol/L脫落酸(ABA)溶液分別淋灌菠蘿組培苗，以及4 ℃低溫處理菠蘿組培苗，48 h后移至25 ℃溫室中，分別于0、1、3、6 、12、24和72 h取樣；剪取菠蘿葉，液氮速凍，-80 ℃保存、備用。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取與cDNA第1鏈的合成參照天根生化科技有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒中的方法提取菠蘿的總RNA。使用超微量紫外分光光度計(Nano-drop 2000C型)測定總RNA的濃度，-80 ℃保存，備用。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉錄成第1鏈cDNA，10倍稀釋后備用。

1.2.2菠蘿VOZ轉錄因子家族基因的擴增根據(jù)Plant Transcription Factor Databasev4.0(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫[10]中菠蘿VOZ轉錄因子家族的相關信息，利用Primer Primer 5.0軟件設計擴增引物AcoVOZ1-F / AcoVOZ1-R和AcoVOZ2-F/AcoVOZ2-R(表1)，以菠蘿葉片cDNA為模板進行擴增。RT-PCR反應擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火40s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3菠蘿VOZ轉錄因子家族的生物信息學分析通過DNAMAN6.0軟件進行高同源蛋白的氨基酸序列比對，并對菠蘿VOZ轉錄因子保守區(qū)域進行分析。通過ExPASy蛋白分析專家系統(tǒng)[11](Expert Protein Analysis System，https://www.expasy.org/)提供的蛋白質在線分析工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的相對分子質量、等電點、穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪系數(shù)、總平均親水性等理化性質，利用PSORT(https://psort.hgc.jp/)在線工具預測菠蘿VOZ蛋白的亞細胞定位。通過在線工具SOPMA(https://www.expasy.org/)預測蛋白質的二級結構，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對蛋白質的三維結構進行預測。

1.2.4菠蘿VOZ轉錄因子家族的差異表達分析為研究不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的差異表達情況，利用Quant Studio 6 Flex的實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，采用UltraSYBR Mixture試劑盒(北京康為世紀)作為熒光試劑進行實時熒光定量PCR操作。建立10 μL的反應體系，每個處理樣本設置3個重復。qRT-PCR反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，40個循環(huán)；在60 ℃時收集熒光信號。根據(jù)AcoVOZ1和AcoVOZ2基因序列設計實時熒光定量PCR引物qAcVOZ1-F/qAcVOZ1-R和qAcVOZ2-F/qAcVOZ2-R(表1)。以菠蘿Actin基因作為內參基因，設計引物qAcoActF / qAcoActR。通過實時熒光定量PCR儀自帶軟件(QuantStudioTM6 Flex)獲得各個樣品的Ct值，以0 hpi的表達量為對照，運用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并對數(shù)據(jù)采用鄧肯新復極差法進行方差分析[12]，確定AcoVOZ1、AcoVOZ2的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 菠蘿VOZ轉錄因子家族基因擴增

PlantTFDB 4.0顯示，菠蘿VOZ轉錄因子家族有2個成員，分別為AcoVOZ1和AcoVOZ2。AcoVOZ1基因包含一個長度為1 542 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼513個氨基酸；AcoVOZ2基因包含一個長度為1 782 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼593

個氨基酸。以菠蘿葉片cDNA為模板，通過RT-PCR擴增得到的AcoVOZ1擴增產(chǎn)物約1 500 bp，AcoVOZ2擴增產(chǎn)物約1 800 bp(圖1)，與預期大小相一致。

2.2 菠蘿VOZ轉錄因子家族特征結構分析

利用DNAMAN對菠蘿AcoVOZ1(Aco000305.1)和AcoVOZ2(Aco005321.1)、擬南芥AtVOZ1(AT1G28520.1、AT1G28520.2)和AtVOZ2(AT2G42400.1)、水稻OsVOZ1(LOC_Os01g54930.1)和OsVOZ2(LOC_Os05g43950.1)的VOZ基因編碼的蛋白進行多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)AcoVOZ1、AcoVOZ2與擬南芥、水稻的VOZ轉錄因子家族存在相似的2個保守域A和B。菠蘿AcoVOZ1的保守域A由約87個氨基酸殘基組成，位置為27～113，B由約217個氨基酸殘基組成，位置為221～437；AcoVOZ2保守域A由約83個氨基酸殘基組成，位置為129～211，B由約206個氨基酸殘基組成，位置為325～530。多重序列比對分析結果顯示B的氨基酸殘基Lys(K)和Leu(L)高度保守(圖2)。

M. DL2000； 1. AcoVOZ1；2. AcoVOZ2；NC.陰性對照圖1 菠蘿VOZ家族基因的擴增M.DL2000；1. AcoVOZ1；2. AcoVOZ2；NC. Negative controlFig.1 Amplification of VOZ genes from pineapple

AcoVOZ1、AcoVOZ2.菠蘿；AtVOZ1、AtVOZ2.擬南芥；OsVOZ1、OsVOZ2.水稻圖2 菠蘿與擬南芥、水稻VOZ家族特征結構域的多重序列比對AcoVOZ1, AcoVOZ2. Pineapple; AtVOZ1, AtVOZ2. Arabidopsis; OsVOZ1, OsVOZ2. RiceFig.2 Multiple sequence alignment of VOZ family in pineapple, Arabidopsis and rice

2.3 菠蘿VOZ轉錄因子家族理化性質及亞細胞定位

通過ExPaSy-ProtParam Tool對AcoVOZ1、AcoVOZ2編碼蛋白的理化性質進行了分析，結果表明，AcoVOZ1編碼的蛋白質分子式為C2497H3897N715O769S17，相對分子質量為56.78 kD，等電點為5.97，不穩(wěn)定系數(shù)為55.18，脂肪系數(shù)為74.62，親水平均數(shù)為-0.586；AcoVOZ2編碼的蛋白質分子式為C2883H4453N811O899S17，相對分子質量為65.40 kD，等電點為5.36，不穩(wěn)定系數(shù)為45.47，脂肪系數(shù)為73.17，親水平均數(shù)為-0.547。因此，預測這2個蛋白都為不穩(wěn)定親水酸性蛋白。

利用PSORT對AcoVOZ1和AcoVOZ2進行亞細胞定位預測，結果顯示，AcoVOZ1蛋白定位于細胞核的可能性為47.8%，AcoVOZ2蛋白定位于細胞核的可能性為69.6%，表明AcoVOZ1和AcoVOZ2定位于細胞核內。

2.4 菠蘿VOZ轉錄因子家族結構預測

通過在線分析工具SOPMA 對AcoVOZ1、AcoVOZ2蛋白的二級結構預測分析結果表明(圖3)，AcoVOZ1蛋白二級結構主要元件是α-螺旋(39.77%)和無規(guī)則卷曲(38.79%)，其次是延伸鏈(12.28%)和β-轉角(9.16%)；AcoVOZ2的蛋白二級結構主要元件是無規(guī)則卷曲(40.3%)和α-螺旋(38.28%)，其次是延伸鏈(13.32%)和β-轉角(8.09%)。

橫坐標表示氨基酸序列位點圖3 菠蘿VOZ家族的二級結構預測The abscissa indicates the position of the amino acid sequence.Fig.3 Secondary structure prediction of VOZ family in pineapple

圖4 菠蘿VOZ家族保守域A和B的三級結構預測Fig.4 Tertiary structure prediction of domain A and B of VOZ family in pineapple

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL軟件對菠蘿AcoVOZ1、AcoVOZ2和擬南芥AtVOZ1(AT1G28520.1)、AtVOZ2(AT2G42400.1)蛋白中保守域A和B的三維結構進行預測(圖4)，在保守域A中，AcoVOZ2含有3個螺旋—環(huán)—螺旋結構，而AcoVOZ1只有1個螺旋—環(huán)—螺旋結構；在保守域B中，AcoVOZ1與AcoVOZ2結構類似，根據(jù)結構決定功能的原理，推測AcoVOZ1與AcoVOZ2功能上也具有相似性。

2.5 不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的表達分析

以菠蘿Actin基因為內參基因，0 h處理為空白對照組。利用實時熒光定量PCR檢測并分析了不同非生物脅迫下菠蘿VOZ家族基因的表達程度。

鹽(NaCl)脅迫條件下(圖5，A)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量呈顯著下降趨勢，并在48 h之后趨于穩(wěn)定，整個過程中AcoVOZ1的表達量均高于AcoVOZ2；PEG6000脅迫條件下(圖5，B)，在處理12 h后，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量均明顯上升，其中AcoVOZ1的表達量達到對照的2.6倍，隨后均顯著下降，但AcoVOZ1在120 h時顯著升高至對照的2.8倍；甘露醇脅迫條件下(圖5，C)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量呈顯著下降趨勢，并在24 h之后趨于穩(wěn)定；H2O2脅迫條件下(圖5，D)，在處理12 h后，AcoVOZ1表達量明顯上升，隨后下降，在48 h時上升至對照組的6.5倍，隨后下降，而AcoVOZ2在H2O2處理后的表達量顯著下降，隨后在48 h時陡然上升后迅速下降，最后恢復至處理前水平；干旱脅迫條件下(圖5，E)，在處理12 h后，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量均明顯下降，并在24 h后趨于穩(wěn)定。

乙烯利(Eth)脅迫條件下(圖5，F(xiàn))，在處理1 h后，AcoVOZ1的表達量明顯下降并趨于穩(wěn)定，在72 h時陡然上升，且達到對照的3.2倍，而在Eth處理后AcoVOZ2的表達量顯著下降并趨于平穩(wěn)；水楊酸(SA)脅迫條件下(圖5，G)，在處理1 h后，AcoVOZ1的表達量顯著上升至對照的3.4倍，并在6 h恢復至處理前水平，而在SA處理后AcoVOZ2的表達量顯著下降并趨于平穩(wěn)；脫落酸(ABA)脅迫條件下(圖5，H)，AcoVOZ1的表達量呈下降趨勢，而AcoVOZ2的表達量迅速下降，隨后在12 h時上升后緩慢下降，但總體低于對照水平；低溫(4 ℃)脅迫條件下(圖5，I)，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量呈明顯下降趨勢，整個過程中AcoVOZ1的表達量均高于AcoVOZ2。

*表示在處理與對照0.05水平上差異顯著圖5 菠蘿VOZ轉錄因子家族在不同非生物脅迫下的表達* indicates significant difference between treatments and control at 0.05 levelFig.5 Expression analysis of VOZ transcription factors in pineapple under different abiotic stress treatments

3 討 論

植物遇到干旱、鹽堿、極端低溫等非生物脅迫時，可以在生理生化和細胞水平上產(chǎn)生響應，以適應或忍耐環(huán)境脅迫，實現(xiàn)正常的生長發(fā)育，確保作物產(chǎn)量和質量[13]。在這個響應過程中，轉錄因子能夠與逆境脅迫相關基因的啟動子區(qū)域的作用元件結合，正向或負向調控相關基因的表達[14]，VOZ轉錄因子便是其中一類。VOZ轉錄因子已經(jīng)在擬南芥[15]、水稻、苔蘚中得到鑒定，并在調控非生物脅迫響應中發(fā)揮重要的作用。

本研究通過生物信息學方法，分析了菠蘿VOZ轉錄因子家族成員的理化性質、二級結構、三級結構等信息，表明AcoVOZ1和AcoVOZ2蛋白都為不穩(wěn)定親水酸性蛋白，與擬南芥、水稻VOZ轉錄因子家族進行序列比對后發(fā)現(xiàn)，VOZ蛋白均包含2個保守域，且保守域B在三級結構上具有一定的相似性，推測它們在功能上也十分相似。qRT-PCR結果顯示，在不同非生物脅迫下，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量與對照差異顯著，這表明AcoVOZ1和AcoVOZ2對非生物脅迫有響應。Nakai等[16]研究認為擬南芥中VOZ蛋白調節(jié)各種逆境，許多與逆境相關的基因在正常生長狀況下發(fā)生了改變，與逆境應答基因的改變相一致，抗凍性和抗旱性在雙突變體voz1voz2中増加，這與本研究結果較為類似。但擬南芥的VOZ基因的雙突變體voz1voz2對病原真菌和病原細菌的抗性卻受到了嚴重的抑制，這可能與非生物脅迫與生物脅迫的機理不同有關。

植物對非生物脅迫的響應極為復雜，非生物脅迫引起的植物生理生化指標改變由植物體內的保護系統(tǒng)和相關基因表達共同調控的，且基因的表達具有組織特異性[17]。本研究中，在鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)、甘露醇、脫落酸(ABA)、乙烯利(Eth)脅迫下，AcoVOZ1和AcoVOZ2的表達量均呈顯著下降趨勢，推測它們以負調控機制響應鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)等非生物脅迫的應答反應。Nakai等[18]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，過度表達VOZ2損害了冷凍和干旱脅迫的耐受性，即損害了非生物脅迫的耐受性，這與本實驗的結果較為類似。

本研究初步確定了菠蘿VOZ轉錄因子家族成員對鹽(NaCl)、干旱、低溫(4 ℃)等非生物脅迫中的響應效應，表明它們在調控非生物脅迫響應中發(fā)揮重要的作用。以上研究，加深了對菠蘿非生物脅迫分子水平上的認識，同時也為后續(xù)對菠蘿VOZ轉錄因子家族成員的功能和作用機制的研究奠定了基礎。