邵帥旭，陳 麗，楊 陽(yáng)，李艷艷，侯喜林，劉同坤*

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2 南京理想農(nóng)業(yè)科技有限公司，南京 210095)

紫菜薹(BrassicacampestrisL. ssp.chinensisvar.purpureaTsen et Lee)又名紅菜薹、紅油菜薹，為十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的變種，一或二年生草本植物，為中國(guó)特產(chǎn)蔬菜，主要分布在長(zhǎng)江流域一帶，營(yíng)養(yǎng)豐富，以其肥嫩多汁、色澤艷麗的花莖為食用器官[1]。利用人工誘變或自然變異等，通過(guò)細(xì)胞染色體組加倍可以獲得多倍體植株[2]。多倍體植物與二倍體植物相比植株個(gè)體更大，一般在葉片、花器官、果實(shí)和種子中表現(xiàn)出巨大性。因此，誘導(dǎo)產(chǎn)生四倍體紫菜薹可獲得更大的花莖，進(jìn)而提高產(chǎn)量，穩(wěn)定并推廣四倍體品種可有效促進(jìn)市場(chǎng)占有率。

多倍體植物的誘導(dǎo)一般分為離體誘導(dǎo)和活體誘導(dǎo)兩種方法[3]。離體誘導(dǎo)是指通過(guò)植物組織培養(yǎng)與秋水仙素相結(jié)合的方法創(chuàng)制出新的種質(zhì)，主要包括浸泡法和混培法[4-9]；活體誘導(dǎo)是指使用一定濃度的秋水仙素或氨磺靈試劑對(duì)子葉期植株的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)滴處理[10-11]。由于離體誘導(dǎo)所需試驗(yàn)條件要求較高[3]，大田種植不能提供離體誘導(dǎo)所需試驗(yàn)環(huán)境，因此，本試驗(yàn)采用活體誘導(dǎo)。參照前人使用秋水仙素對(duì)植物進(jìn)行誘導(dǎo)加倍的結(jié)果，誘導(dǎo)不結(jié)球白菜‘依玲’使用濃度為0.2%的秋水仙素處理4次誘導(dǎo)效果最好，四倍體加倍率為7.64%[12]，誘導(dǎo)蘿卜使用濃度為0.15%秋水仙素處理4次誘導(dǎo)效果最好，四倍體加倍率為8.6%[13]。本試驗(yàn)以0.1%為梯度分別設(shè)置0.1%、0.2%和0.3% 3個(gè)濃度對(duì)紫菜薹莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行4次處理，嘗試誘導(dǎo)獲得四倍體紫菜薹植株。

鑒定多倍體的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、解剖學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定等[3, 14-15]，流式細(xì)胞儀分析法通過(guò)測(cè)定細(xì)胞經(jīng)碘化丙啶(Propidium Iodide)染色后顯示的DNA熒光強(qiáng)度來(lái)比較染色體倍性，是近幾年發(fā)展起來(lái)的較為快捷、準(zhǔn)確的鑒定多倍體植株的方法，已在獼猴桃[16]、不結(jié)球白菜[12]等植物倍性鑒定上有所應(yīng)用，但由于不同植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同及次級(jí)代謝產(chǎn)物的特殊性和復(fù)雜性，流式細(xì)胞儀鑒定植株倍性的適用性與實(shí)驗(yàn)方法也存在差異[17-18]。本試驗(yàn)在使用流式細(xì)胞儀對(duì)紫菜薹植株進(jìn)行倍性鑒定時(shí)首次提出以Tris-MgCl2為解離液并成功鑒定出二倍體和四倍體紫菜薹植株，為十字花科植物應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定提供了一種新的試驗(yàn)方法。

多倍體植株在園藝生產(chǎn)中表現(xiàn)出來(lái)的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官增大、營(yíng)養(yǎng)成分增多、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等特征是人為誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體的根本原因[2, 14]。本試驗(yàn)使用秋水仙素對(duì)二倍體紫菜薹植株進(jìn)行誘導(dǎo)獲得四倍體植株，并對(duì)獲得的四倍體紫菜薹植株與對(duì)照進(jìn)行品質(zhì)鑒定和農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)，以期得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)豐富的新品種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以南京理想種苗有限公司種植的紫菜薹為試驗(yàn)材料，2n=2x=20。試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白菜系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室以及南京理想種苗有限公司試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 誘導(dǎo)方法

在紫菜薹幼苗子葉完全展開(kāi)時(shí)，采用秋水仙素溶液點(diǎn)滴幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)，每天上午(9:00)和下午(17:00)各處理1次，秋水仙素濃度設(shè)定為0.1%、0.2%、0.3% 3個(gè)水平，每個(gè)濃度分別處理4次，每次處理點(diǎn)滴0.2 mL，以蒸餾水作對(duì)照(CK)。

1.3 鑒定方法

1.3.1形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)鑒定二倍體和四倍體植物在形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)存在明顯差異[10, 19-20]，根據(jù)葉型、葉色、花器官、種子大小等相關(guān)形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行初步篩選與鑒定；解剖學(xué)鑒定則根據(jù)氣孔大小、氣孔密度、花粉大小、花粉形狀等相關(guān)指標(biāo)對(duì)誘導(dǎo)小區(qū)進(jìn)行篩選，進(jìn)一步確定誘導(dǎo)產(chǎn)生的疑似植株。

1.3.2細(xì)胞學(xué)鑒定將收取的紫菜薹疑似株種子在培養(yǎng)皿中催芽，待其生根后取1～2 cm根尖，在0.02 mg·L-18-羥基喹啉中預(yù)處理4 h，卡諾試劑固定24 h，再使用1 mol·L-1HCl在60 ℃條件下解離4 min，用壓片法制片，使用改良品紅進(jìn)行染色，在Olympus倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.3.3流式細(xì)胞儀鑒定通過(guò)流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD Accuri)對(duì)植株進(jìn)行DNA含量分析鑒定。從疑似株上進(jìn)一步選取0.05 g幼嫩的葉片，在裝有1 mL解離液[200 mmol·L-1Tris，4 mmol·L-1MgCl2·6H2O，0.5%(V/V)TritonX-100, pH 7.5]的玻璃培養(yǎng)皿中快速切碎，40 μm過(guò)濾器過(guò)濾至1.5 mL離心管，冰上孵育5～10 min，1 000 r·min-1低溫離心5 min棄上清液，再加入1 mL預(yù)冷的Tris-MgCl2緩沖液，1 000 r·min-1低溫離心5 min后，棄上清液，再加入0.5 mL預(yù)冷的Tris-MgCl2緩沖液，加入核糖核酸酶(RNase A)和熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide)混勻，避光染色15 min后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 二倍體和四倍體紫菜薹營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)鑒定以及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

對(duì)鑒定為四倍體的紫菜薹植株M0代進(jìn)行嚴(yán)格的蕾期單株自交授粉并單株收種，將獲得的M1代種子，與對(duì)照在2017年11月3日同時(shí)播種，在2018年1月8日進(jìn)行品質(zhì)鑒定以及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)。各選取6株二倍體和四倍體紫菜薹植株，取各植株同一部位的葉片，測(cè)定硝態(tài)氮、可溶性蛋白、維生素C、游離氨基酸、可溶性糖、纖維素含量和葉綠素總濃度[21-22]，并各取10株二倍體和四倍體紫菜薹植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)，考察性狀主要包括株高、單株質(zhì)量、葉片數(shù)、十葉厚、開(kāi)展度、葉長(zhǎng)、葉寬、葉柄長(zhǎng)、葉柄寬、葉柄厚[14, 23]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SAS 9.2對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度秋水仙素處理對(duì)二倍體紫菜薹誘導(dǎo)的影響

由表1可知，使用0.1%～0.3%濃度的秋水仙素處理4次均可以誘導(dǎo)紫菜薹植株發(fā)生變異，且隨著秋水仙素濃度的提高，處理植株與對(duì)照植株相比形態(tài)上發(fā)生變化的比率越高，即紫菜薹植株變異率逐漸升高，其中秋水仙素濃度為0.3%時(shí)紫菜薹植株的變異率為17.24%；而秋水仙素對(duì)紫菜薹植株進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生四倍體植株的加倍率卻隨著秋水仙素濃度的升高而先升高后降低，并在秋水仙素濃度為0.2%時(shí)誘導(dǎo)效果最佳，總計(jì)誘導(dǎo)得到9株四倍體植株，四倍體加倍率為6.62%。

2.2 紫菜薹植株的形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)鑒定結(jié)果分析

根據(jù)處理植株與對(duì)照植株之間存在的形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)差異進(jìn)行篩選鑒定，選出差異明顯的標(biāo)記為疑似植株并拍照記錄，結(jié)果如圖1。其中，疑似植株與對(duì)照植株相比葉片顏色加深、變大、圓潤(rùn)、葉柄變寬、葉片邊緣出現(xiàn)鋸齒(圖1，A、B)；花朵形狀相對(duì)于二倍體更加緊湊、單花瓣形狀偏圓，與二倍體相比雌蕊個(gè)體變大(圖1，C)；花簇變大、顏色鮮艷(圖1，

表1 不同濃度秋水仙素誘導(dǎo)四倍體紫菜薹的效果

注：成活率%=成活株數(shù)/總樣本量(于成株期統(tǒng)計(jì))；變異率%=變異數(shù)/總樣本量(于苗期統(tǒng)計(jì))；加倍率%=四倍體株數(shù)/總樣本量(于成株期統(tǒng)計(jì))

Note: Survival rate% =Survival number/Total sample size (in the adult statistics); Variation rate%=Variation number/Total sample size (in seeding statistics); Double rate%=Tetraploid number of plants/Total sample size (in the adult statistics)

D)。種子直徑變大，角果變粗、顏色加深(圖1，E、F)；顯微鏡觀察下視野內(nèi)氣孔密度變小、氣孔變大(圖1，G、H)?；ǚ鄢尸F(xiàn)出明顯的不同于二倍體植株的不規(guī)則狀，顯微鏡下觀察到矩形、梯形、菱形花粉(圖1，I、J)。

2.3 紫菜薹植株的細(xì)胞學(xué)鑒定分析

取部分經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)鑒定過(guò)的疑似四倍體紫菜薹植株收獲的種子進(jìn)行催芽使其生根，對(duì)收獲的根尖進(jìn)行染色體鑒定，部分疑似植株染色體鑒定結(jié)果如圖2所示，二倍體植株染色體數(shù)目為2n=2x=20，疑似植株根尖染色體數(shù)目為2n=4x=40，直觀的鑒定出本次試驗(yàn)誘變成功，并得到四倍體紫菜薹植株。

2.4 紫菜薹植株的流式細(xì)胞儀鑒定分析

選取疑似植株0.05 g新鮮葉片通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量鑒定。結(jié)果如圖3，圖中峰值橫坐標(biāo)的位置顯示為被測(cè)紫菜薹的DNA熒光強(qiáng)度，對(duì)照組紫菜薹DNA熒光強(qiáng)度顯示為956 725.15，疑似株DNA熒光強(qiáng)度為2 092 385.03，約為二倍體植株的2倍，表明疑似植株是四倍體(4x)。

2.5 二倍體和四倍體紫菜薹植株?duì)I養(yǎng)品質(zhì)比較

由表2可知，四倍體紫菜薹硝態(tài)氮、可溶性蛋白、可溶性糖、維生素C、纖維素含量分別比二倍體降低了48.99%、43.20%、44.50%、45.81%和59.97%，并差異極顯著；而四倍體紫菜薹葉綠素總濃度和游離氨基酸總量分別比二倍體增加了110.02%和228.58%，兩者間也差異極顯著。

2.6 二倍體與四倍體紫菜薹植株農(nóng)藝性狀比較

由表3可知，四倍體紫菜薹植株的單株質(zhì)量、十葉厚、葉寬、葉柄寬、葉柄厚分別比二倍體植株上升了37.79%、46.01%、20.57%、16.67%和24.48%，且十葉厚、葉寬、葉柄寬差異達(dá)極顯著水平，單株質(zhì)量、葉柄厚達(dá)差異顯著水平；同時(shí)，在開(kāi)展度方面，四倍體植株相對(duì)于二倍體植株在開(kāi)展長(zhǎng)度上降低17.62%，并具有顯著差異，而在開(kāi)展寬度上四倍體植株降低了12.55%，但沒(méi)有顯著性差異；另外，四倍體株高、葉片數(shù)分別比二倍體增加2.58%和2.38%，而葉長(zhǎng)、葉柄長(zhǎng)卻分別減少5.59%和13.13%，但這些指標(biāo)在二倍體和四倍體植株之間均沒(méi)有顯著性差異。

A.植株；B.葉片；C.花器官；D.花；E.種子；F.角果； G、H.氣孔；I、J.花粉圖1 二倍體與四倍體紫菜薹植株各器官差異比較A. Plant; B. Leaf; C. Floral organ; D. Flower; E. Seed; F. Silique; G and H. Stomata; I and J. PollenFig.1 Comparing the differences of organs between diploid and tetraploid purple tsai-tai

圖2 二倍體與四倍體紫菜薹細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果Fig.2 The cytological identification of diploid and tetraploid Purple Tsai-tai

圖3 二倍體與四倍體紫菜薹流式細(xì)胞儀倍性鑒定結(jié)果Fig.3 The ploidy identification results of diploid and tetraploid Purple Tsai-tai by flow cytometry

營(yíng)養(yǎng)指標(biāo) Nutritional index 材料 Material2x4x增加率 Increase rate[(4x-2x)/2x]/%硝態(tài)氮含量Nitric nitrogen content/(mg·g-1)205.28aA104.72bB-48.99可溶性蛋白含量Soluble protien content/(mg·g-1)71.32aA40.51bB-43.20可溶性糖含量Soluble sugar content/(mg·g-1)19.05aA10.57bB-44.50維生素C含量Vitamin C content/(mg·g-1)14.43aA7.82bB-45.81纖維素含量Fibrin content/(mg·g-1)3.69aA1.50bB-59.97葉綠素總濃度Total chlorophyll concentration/(mg·g-1)6.76bB14.20aA110.02游離氨基酸總量Total contents of free amino acid/(mol·g-1)27.56bB90.55aA228.58

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)和大寫(xiě)字母分別表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)；下同

Note: Different normal and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels，respectively. The same as below

表3 二倍體與四倍體紫菜薹主要農(nóng)藝學(xué)性狀比較

3 討 論

多倍體植株的鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定、解剖學(xué)鑒定、細(xì)胞學(xué)鑒定、流式細(xì)胞儀鑒定等[3, 14-15]。形態(tài)學(xué)鑒定主要依據(jù)二倍體和四倍體植株存在的表觀性狀差異性進(jìn)行鑒定，解剖學(xué)鑒定則依據(jù)二倍體和四倍體植株在花粉、氣孔等方面存在的差異進(jìn)行鑒定，因此在對(duì)四倍體植株進(jìn)行鑒定時(shí)通過(guò)形態(tài)學(xué)與解剖學(xué)觀察植株的生長(zhǎng)狀況特征與花粉、氣孔的差異進(jìn)行初步篩選鑒定可有效提高鑒定效率。細(xì)胞學(xué)鑒定與流式細(xì)胞儀鑒定法則可以直觀準(zhǔn)確地區(qū)分二倍體和四倍體植株[23]，細(xì)胞學(xué)鑒定則根據(jù)取材部位與觀察時(shí)期的不同一般可分為花粉母細(xì)胞鑒定和根尖染色體鑒定[20, 24]。

本試驗(yàn)采用根尖染色體進(jìn)行鑒定，將經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)鑒定篩選后的疑似植株在蕾期單株授粉，以收獲的種子為材料進(jìn)行鑒定。細(xì)胞學(xué)鑒定法可以準(zhǔn)確、直觀地分辨出二倍體和四倍體植株，但是操作流程復(fù)雜無(wú)法大規(guī)模進(jìn)行鑒定[25-26]，且以根尖為材料進(jìn)行染色體鑒定需取用誘變植株收獲的種子作為試驗(yàn)材料，無(wú)疑大大增加了四倍體育種的育種年限。流式細(xì)胞儀鑒定法則是通過(guò)檢測(cè)植物體內(nèi)DNA相對(duì)含量[27-29]進(jìn)而鑒定植物的倍性，整個(gè)試驗(yàn)高效、準(zhǔn)確，還可以鑒定出來(lái)非整倍體和嵌合體[28]，相對(duì)于根尖染色體的鑒定更加方便，且可以在四倍體育種過(guò)程中對(duì)誘變的初代植株進(jìn)行鑒定，明顯縮減了育種周期。在以后的四倍體植株鑒定過(guò)程中，以流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果為主并以細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果為輔，將會(huì)顯著降低育種工作量，縮減育種周期，在指導(dǎo)生產(chǎn)方面具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

多倍體植株在園藝生產(chǎn)中普遍比二倍體植株具有更高的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、產(chǎn)量和抗逆性[2,30-31]，而本試驗(yàn)中對(duì)誘導(dǎo)得到四倍體紫菜薹植株與二倍體植株進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)四倍體紫菜薹的硝態(tài)氮、可溶性蛋白、可溶性糖、維生素C、纖維素含量均低于二倍體紫菜薹植株，而葉綠素總濃度和游離氨基酸總量高于二倍體紫菜薹植株，明顯不符合四倍體植株?duì)I養(yǎng)品質(zhì)高于二倍體植株的預(yù)期。對(duì)二倍體和四倍體植株的農(nóng)藝性狀鑒定結(jié)果則顯示：四倍體紫菜薹相對(duì)于二倍體紫菜薹單株質(zhì)量有明顯提高，而株高沒(méi)有明顯差異性，進(jìn)而不能表現(xiàn)出‘巨大性’，同時(shí)，開(kāi)展長(zhǎng)度小于二倍體植株，而在葉厚、葉寬、葉柄寬、葉柄厚等方面卻顯著增加，使四倍體的株高特征向矮小、緊湊型發(fā)展[14,32-33]，在生產(chǎn)時(shí)可以使小區(qū)內(nèi)種植密度增加，進(jìn)而增加單位面積產(chǎn)量。

通常來(lái)講，人工誘導(dǎo)四倍體植株使其染色體發(fā)生變異，是四倍體相對(duì)于二倍體植株具有優(yōu)勢(shì)的根本原因[15]，而本次試驗(yàn)誘導(dǎo)得出四倍體植株?duì)I養(yǎng)品質(zhì)卻低于二倍體植株，出現(xiàn)這種情況的原因仍需進(jìn)一步研究。但在自然界中植物的多倍體化是推進(jìn)植物進(jìn)化與物種形成的一個(gè)重要原因[34]，因此人工誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生在多倍體育種過(guò)程中仍然具有十分重要的指導(dǎo)意義。