劉雙雙，蔣學(xué)飛，岳 出，王茂林

(四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都 610064)

TCP轉(zhuǎn)錄因子家族是根據(jù)玉米(Zeamays)中的TEOSINTEBRANCHE1 (TB1)、金魚草(Antirrhinummajus)中的CYCLOIDEA(CYC)以及水稻(Oryzasativa)中的PROLIFERRATINGCELLFACTORS1和2(PCF1和PCF2)的3個基因的首字母來命名的[1]。TCP家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[2]，含有一個bHLH motif，能夠與DNA結(jié)合或者產(chǎn)生蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作[3]?；赥CP結(jié)構(gòu)域序列上的差別，TCP轉(zhuǎn)錄因子家族被分為2個亞家族：classⅠ(PCF或TCP-P)和Ⅱ(TCP-C)，主要是因為classⅠ和Ⅱ相比，在TCP基本結(jié)構(gòu)域上缺失了1個包含4個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)，此外classⅠ和Ⅱ的蛋白識別位點也有所差異，分別為GGNCCCAC和G(T/C)GGNCCC[4]。TCP家族參與了調(diào)控植物細胞增殖和分化，其中classⅠ類在植物生長以及脅迫應(yīng)答中起正調(diào)控作用，而classⅡ則與Ⅰ類功能有所拮抗[5]。

據(jù)報道，通過酵母單雜交篩選分離方法，得到的TCP家族AtTCP7基因可能是擬南芥miR168a調(diào)節(jié)因子，但在體內(nèi)實驗中，通過過量表達該基因和GUS染色發(fā)現(xiàn)，AtTCP7可能不直接與miR168a的啟動子作用。在轉(zhuǎn)基因品系的表型分析中發(fā)現(xiàn)多種生長缺陷和發(fā)育延遲，包括根較短、開花延遲和育性降低等特征。不同發(fā)育階段分析表明，過表達AtTCP7通過改變細胞周期基因表達限制細胞從G1到S期的轉(zhuǎn)變，在不同器官中差異性地影響細胞大小和DNA含量。同時，TCP家族成員之間存在復(fù)雜的相互作用遺傳網(wǎng)絡(luò)，特別是TCP7和TCP23之間通過相互作用發(fā)揮功能[6]。在擬南芥TCP蛋白相互作用中發(fā)現(xiàn)：TCP7/8/22/23在幼葉生長中具有相似表達模式，TCP4/7/9/14/15/17/21/22/23在花的發(fā)育中的功能可能具有相似性[7]。最近也有文獻報道，擬南芥中classⅠ類的6個TCPs基因可能是3對重復(fù)基因，分別為tcp6-tcp20、tcp7-tcp21和tcp9-tcp19[8]。最近，蕪菁(Brassicarapa)基因組TCP家族分析發(fā)現(xiàn)TCP7基因存在BrrTCP7、BrrTCP7a和BrrTCP7b等3種，且BrrTCP7在根、莖、葉中均呈現(xiàn)高表達，BrrTCP7a在所有器官中的表達水平較低，而BrrTCP7b在葉片和花中表達量較高。通過酵母雙雜交技術(shù)研究蕪菁TCP蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)TCP7幾乎與所有BrrTCP蛋白均能產(chǎn)生同源或異源二聚體[9]。

目前針對甘藍型油菜TCP7基因在植物生物脅迫和非生物脅迫方面的研究還比較少。油菜屬于十字花科、蕓薹屬植物，是世界重要的油料作物之一，也是主要經(jīng)濟作物[10]，本研究通過克隆后比對分析，獲得了甘藍型油菜預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子TCP7-like同源編碼基因，命名為BnTCP7，分析了該基因的氨基酸序列和表達模式，為深入研究油菜BnTCP7在植物抗逆響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

甘藍型油菜(Brassicanapus)‘3529’由本課題組提供，種植于四川大學(xué)試驗地。

1.2 方 法

1.2.1BnTCP7編碼區(qū)全長的克隆按照植物總RNA提取試劑盒(OMEGA公司)說明書，以油菜葉片為實驗材料提取總RNA，cDNA第一鏈合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Remvoal and cDNA Synthesis Super Mix(全式金生物公司)的操作步驟進行。反轉(zhuǎn)錄后用內(nèi)參基因-Actin檢測cDNA質(zhì)量，合成的cDNA可直接作為PCR反應(yīng)模板使用，或者-20 ℃保存。參考轉(zhuǎn)錄組BnTCP7基因的ORF序列，利用Primer3 Plus在線設(shè)計引物(表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA純化回收試劑盒(天根生物公司)按照從PCR反應(yīng)液直接回收方法進行回收，

表1 引物序列

回收產(chǎn)物連接Peasy-T1載體(全式金生物公司)，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細胞。藍白斑篩選陽性克隆后，經(jīng)菌液PCR檢測，選取陽性菌落接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。按照質(zhì)粒小提試劑盒(天根生物公司)說明書的方法進行提取，后送生物公司(深圳華大基因有限公司)測序。

1.2.2BnTCP7基因編碼區(qū)序列的生物信息分析目的基因測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析。將BnTCP7基因序列在GenBank中進行Blast比對，利用BnTCP7基因的預(yù)測氨基酸序列進行氨基酸序列比對分析。BnTCP7蛋白理化性質(zhì)通過Protparam[11]在線軟件分析，BnTCP7蛋白親水/疏水性使用ProtScale在線分析軟件Kyteand Doolittle算法進行預(yù)測。使用SOPMA[12]對BnTCP7蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，而BnTCP7蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模應(yīng)用SwissModel在線工具分析。用MEGA 7. 0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3不同時期不同器官BnTCP7基因的表達模式分析根據(jù)本課題組已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析甘藍型油菜‘3529’各個時期各個器官中BnTCP7基因的表達模式，為深入研究BnTCP7基因功能提供依據(jù)。

1.2.4BnTCP7基因在逆境脅迫和外源激素處理下的表達模式分析甘藍型油菜品系‘3529’露天盆栽，培養(yǎng)至幼苗3～4片真葉時，開始進行脅迫及激素處理。激素處理為100 μmol/L ABA和100 μmol/L GA3，分別添加 0.05%(V/V)乙醇和0.01% Tween-20表面活性劑，噴施葉面和澆灌根部；損傷處理為用打孔器在葉片上打孔(30%體積)；高溫、低溫處理為將甘藍型油菜幼苗分別放置40 ℃光照培養(yǎng)箱和4 ℃冷室內(nèi)，正常光照進行處理；未經(jīng)過任何處理的作為空白對照。所有材料在處理后 0、0.5、1、2、4、8和16 h 取生長狀況一致的幼苗地上部分，液氮冷凍后于-80 ℃保存。以油菜管家基因 -Actin(GenBank登錄號AF111812)作為內(nèi)參基因，設(shè)計特異性引物(表1)，qRT-PCR檢測BnTCP7基因在不同脅迫、不同時間點下的表達情況。熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad CFX96。熒光定量試劑盒采用TransStart Tip Green qPCR Super Mix(全式金生物公司)。qRT-PCR反應(yīng)20 μL體系如下：10 μL 2×Master Mix，1 μL模板cDNA，10 μmol/L正反向引物各1 μL，7 μL ddH2O。qRT-PCR采用三步法，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s，42個循環(huán)(94 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s 及72 ℃ 10 s)，同時繪制熔解曲線(65 ℃上升至95 ℃，每個循環(huán)上升0.5 ℃)。反應(yīng)結(jié)束后，目標(biāo)基因表達水平運用相對定量的2-ΔΔCt法[13]，得到BnTCP7基因的相對表達量，每個樣品都進行3次重復(fù)實驗。數(shù)據(jù)采用SPSS進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BnTCP7基因全長的克隆與編碼蛋白質(zhì)分析

由甘藍型油菜苗期葉片為材料獲得的cDNA為模板通過PCR擴增(圖1)，得到648 bp編碼區(qū)全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接T載體并轉(zhuǎn)化涂在具有卡那抗性的平板上，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行重組子鑒定后擴大培養(yǎng)，菌液送深圳華大基因有限公司測序，測序后利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blastn比對，成功獲得TCP7基因，命名為BnTCP7。將克隆得到的序列與甘藍型油菜基因組序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)與甘藍型油菜預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子TCP7-like(NC_027757)為同源基因，核苷酸序列相似性最高，為95.68%。同時，其氨基酸序列與十字花科(Brassicaceae)中19條TCP7或者TCP7-like基因的氨基酸序列比對，結(jié)果(圖2)表明，擬南芥屬、亞麻薺屬、蕓薹屬和蘿卜屬等TCP7間同源蛋白具有很高的相似性和保守性，尤其表現(xiàn)在靠近N端的TCP保守結(jié)構(gòu)域。

2.2 BnTCP7蛋白性質(zhì)與結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

2.2.1氨基酸序列理化性質(zhì)分析BnTCP7蛋白理化性質(zhì)利用在線軟件Protparam分析。BnTCP7蛋白相對分子質(zhì)量為23 018.77；不穩(wěn)定系數(shù)是47.77(不穩(wěn)定系數(shù)大于40時，預(yù)測蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反之則穩(wěn)定)，為不穩(wěn)定類蛋白；等電點為9.38；總平均疏水性為-0.457。結(jié)果表明，該蛋白為不穩(wěn)定、親水性蛋白。

M. 250 bp DNA ladder; 1.‘3529’圖1 BnTCP7 基因 PCR 擴增片段Fig.1 PCR amplified fragment of BnTCP7

2.2.2BnTCP7蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測利用SOPMA對BnTCP7蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測[12]，并與擬南芥AtTCP7(NC_003076)蛋白預(yù)測結(jié)構(gòu)進行比對，圖3，A1和3，A2分別為BnTCP7和AtTCP7蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，主要顯示蛋白結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-片層等結(jié)構(gòu)。應(yīng)用SwissModel在線工具對BnTCP7及AtTCP7氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)同源建模。BnTCP7氨基酸序列預(yù)測得到三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象有2個，構(gòu)象1和構(gòu)象2分別見圖3，B1、B2，2個構(gòu)象共存時構(gòu)象見圖3，B3；AtTCP7氨基酸序列預(yù)測得到的三級結(jié)構(gòu)關(guān)鍵構(gòu)象也具有2個獨立構(gòu)象(圖3，C)；圖3，B3和圖3，C中構(gòu)象均存在螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，進一步證明屬于TCP家族，且BnTCP7和AtTCP7部分構(gòu)象一致。

NC_027757、NC_027774、NC_027762、NC_027768、NC_027758. 甘藍型油菜; NC_024795v、NC_024800、NC_024796. 白菜; NC_027756、NC_027754、NC_027749. 甘藍; NW_017353147、NW_017353142. 蘿卜; NC_025697、NC_025692、NC_025704. 亞麻芥屬; NW_003302550.琴葉擬南芥; NC_003076. 擬南芥圖2 BnTCP7與十字花科中其他19個TCP7或TCP7-like氨基酸序列比對NC_027757, NC_027774, NC_027762, NC_027768, NC_027758. Brassica napus (rape); NC_024795v, NC_024800, NC_024796. Brassica rapa (field mustard); NC_027756, NC_027754, NC_027749. Brassica oleracea (wild cabbage); NW_017353147, NW_017353142, NW_017353144. Raphanus sativus (radish); NC_025697, NC_025692, NC_025704. Camelina sativa (false flax); NW_003302550. Arabidopsis lyrata; NC_003076. Arabidopsis thalianaFig.2 Comparison of BnTCP7 with other 19 TCP7 or TCP7-like amino acids in Brassicaceae

A1. BnTCP7蛋白二級預(yù)測結(jié)構(gòu); A2. AtTCP7蛋白二級預(yù)測結(jié)構(gòu); B1. BnTCP7蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測構(gòu)象1; B2. BnTCP7蛋白三級機構(gòu)預(yù)測構(gòu)象2; B3.構(gòu)象1和構(gòu)象2共存時構(gòu)象; C. AtTCP7蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測構(gòu)象; A1、A2中綠色為β-轉(zhuǎn)角，紅色為片層，紫色為無規(guī)卷曲，藍色為α-螺旋圖3 BnTCP7 蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測A1. Prediction of protein secondary structure of BnTCP7; A2. Prediction of protein secondary structure of AtTCP7; B1. Prediction of protein tertiary structure of model1 in BnTCP7; B2. Prediction of protein tertiary structure of model 2 in BnTCP7; B3. Conformation of the coexistence of model1 and model 2; C. Prediction of protein secondary structure of AtTCP7; A1, A2. Green: β-turn; Red: extended; Purple: random, coil, strand; Blue: α-helix.Fig.3 Prediction of secondary and tertiary structures of BnTCP7 protein

2.3 BnTCP7蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

為研究十字花科植物TCP7基因的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化情況，對NCBI數(shù)據(jù)庫十字花科中19個TCP7及TCP7-like基因預(yù)測的氨基酸序列構(gòu)建進化樹，其中涉及4個屬分別為擬南芥屬、亞麻薺屬、蕓薹屬和蘿卜屬，并結(jié)合BnTCP7基因預(yù)測的氨基酸序列構(gòu)建進化樹。利用MEGA7.0軟件[14]中Neighbor Joining算法[15]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[16](圖4)，使用泊松校正方法計算進化距離[17]。結(jié)果表明，20條蛋白序列具有很高的同源性，BnTCP7與Brassicanapus(rape)NC_027757聚在同小一分支，親緣關(guān)系最近；與Raphanussativus(radish)NW_017353147等聚在同一大分支，與陸奇豐等結(jié)果相同[18]。進化距離表明，20個基因的蛋白質(zhì)遺傳進化距離很近，進一步說明該TCP家族蛋白質(zhì)遺傳進化比較保守。

2.4 不同時期不同器官BnTCP7基因的表達模式分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對不同時期不同器官BnTCP7基因在‘3529’中的表達模式分析，結(jié)果如圖5所示。各個時期各個器官中BnTCP7基因的表達呈現(xiàn)一定差異性，BnTCP7基因在花期莖中表達量相對最高，而在花期葉、角果期角果中表達量相對較少，其中角果中表達量最低；BnTCP7基因在苗期和抽薹期各部位中表達量差異不顯著，而在花期葉片中表達量較其他組織部位低。

圖4 BnTCP7與十字花科中其他19個TCP7或TCP7-like蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of BnTCP7 with other 19 TCP7 or TCP7-like protein in Brassicaceae

2.5 非生物脅迫和外源激素處理下BnTCP7的表達模式分析

通過分析甘藍型油菜‘3529’不同時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)BnTCP7基因在苗期表達量較穩(wěn)定；并且，苗期更適宜于研究BnTCP7基因?qū)Ψ巧锩{迫和外源激素處理的響應(yīng)，因此本實驗選用苗期材料。非生物脅迫和外源激素處理后苗期中BnTCP7表達量變化如圖6所示，其中不同脅迫處理實驗均以β-Actin為內(nèi)參基因，以0 hBnTCP7在‘3529’中的表達量為1得到不同時間段‘3529’中BnTCP7基因的相對表達量。

分析發(fā)現(xiàn)，‘3529’在冷脅迫下，BnTCP7表達量隨著時間延長逐步降低，在8 h表達量達到最低。而在熱脅迫下，BnTCP7表達量隨著時間的變化呈先下降后上升趨勢，在2 h表達量達到最低點。損傷脅迫下，BnTCP7表達量在0.5 ～ 4 h時間段內(nèi)穩(wěn)定低表達，但在8 h大幅升高至0 h表達水平，差異不顯著，后繼續(xù)下降。在ABA和GA3處理后，BnTCP7表達量在早期都呈大幅度下降趨勢，但是它們下降到最低值的時間點和恢復(fù)到最高值的時間點均不一樣，其中GA3處理下，BnTCP7在0.5 h下降至最低點后逐漸上升并在2 h表達量上升到初始狀態(tài)，2 h后下降并呈穩(wěn)定低表達；施加外源ABA后，BnTCP7表達量在1 h下降到最低點后逐步上升，且8 h表達量高于處理前狀態(tài)后下降。

ss.苗期; bs.抽薹期; fs.花期; ps.角果期圖5 ‘3529’不同時期不同器官BnTCP7基因的相對表達量WT represent ‘3529’ of Brassica napus; ss represent the seedling stage; bs represent the bolting stage; fs represent the flowering period; ps represent siliquing stageFig.5 Analysis of BnTCP7 gene’s relative expression in different stages and organs of ‘3529’

*代表該處理下BnTCP7基因表達量與0 h(未處理)的表達量存在顯著差異(P<0.05)圖6 非生物脅迫和外源激素處理下BnTCP7基因的相對標(biāo)準(zhǔn)表達量*means that the expression of BnTCP7 gene there is a significant difference between the treatment time 0 h (untreated conditions) and other treatment time under the same condition at 0.05 levelFig.6 Relative normalized expression levels of BnTCP7 under abiotic stresses and hormone treatments

綜上，表達量總體變化趨勢分為兩類：第一類，BnTCP7在損傷脅迫和外源激素ABA及GA3處理下基因表達量隨著處理時間延長，均為先下降再上升后下降趨勢；第二類，在冷、熱脅迫處理條件下基因表達量隨著脅迫時間延長，整體呈下降趨勢?？傊?，非生物脅迫和外源激素處理下，‘3529’中BnTCP7的表達量與0 h相比均整體呈下降狀態(tài)且差異顯著(P<0.05)。說明BnTCP7參與到了冷、熱、損傷脅迫中,并受ABA及GA3激素的影響。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御外界生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，且在不同物種中其功能高度保守[19]。其中，TCP轉(zhuǎn)錄因子參與多種激素信號通路的調(diào)節(jié)，且具增強植物抵御外界脅迫的能力[20]。據(jù)報道，白樺BpTCP7基因過表達提高了鹽、旱耐受能力[6]，水曲柳FmTCP4基因能夠被寒冷、鹽、干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達，并參與了ABA和GA3的激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[4]。目前，TCP家族在擬南芥[21]、水稻[22]和番茄[23]中研究比較多，但對蕓薹屬植物的研究比較少，特別是甘藍型油菜抗逆響應(yīng)方面。本研究通過基因克隆、序列比對分析獲得了甘藍型油菜轉(zhuǎn)錄因子TCP7-like同源基因，命名為BnTCP7，屬于TCP家族classⅠ類，與TCP7-likeNC_027757基因核苷酸序列具有最高的相似性(95.68%)。生物信息學(xué)結(jié)果表明BnTCP7蛋白為親水性蛋白，同時，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫十字花科中19個TCP7及TCP7-like基因的蛋白序列構(gòu)建進化樹。氨基酸序列比對、BnTCP7蛋白三級結(jié)構(gòu)同源建模及進化樹分析等進一步驗證BnTCP7蛋白具有bHLH(basic helix-1oop-helix)結(jié)構(gòu)與陸奇豐等[18]及劉春浩等[4]結(jié)論一致，屬于TCP家族，與TCP7-likeNC_027757基因具有最近的遺傳進化關(guān)系。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究分析了BnTCP7基因在不同時期不同器官中的表達模式。BnTCP7基因在營養(yǎng)器官中的表達量高于生殖器官，且在營養(yǎng)生長階段表達趨于穩(wěn)定，結(jié)合TCP家族在植物生長發(fā)育中的作用，推測可能TCP家族基因更多地參與植物營養(yǎng)生長階段。此外，甘藍型油菜‘3529’苗期在不同脅迫處理后葉中BnTCP7基因表達的模式分析表明，在非生物脅迫和激素處理下，甘藍型油菜‘3529’中BnTCP7表達量隨時間的改變而變化顯著。同時，值得注意的是在ABA和GA3處理后，BnTCP7表達量變化趨勢一致，但是BnTCP7對2種激素的響應(yīng)快慢不一，即ABA處理下響應(yīng)速度快于GA3處理，推測可能和油菜內(nèi)源激素水平有關(guān)，因為有研究發(fā)現(xiàn)苗期至盛花期GA3水平高于ABA[24]。

總之，BnTCP7基因不僅響應(yīng)冷、熱、損傷的非生物脅迫，并且參與ABA和GA3激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，說明甘藍型油菜BnTCP7基因可能在植物抵抗逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，為進一步研究TCP轉(zhuǎn)錄因子在甘藍型油菜抗逆機制中的作用提供參考。