周于波，朱 鵬，龔 偉*，王景燕，閆思宇，吳開志

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院, 林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130; 2 四川省林木種苗站, 成都 610081)

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，胡桃科(Juglandaceae)核桃屬(Juglans)植物，落葉喬木，與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名四大干果[1]。核桃是中國傳統(tǒng)果樹，主要分布于中國云南、四川、新疆、貴州等地。四川是核桃種植大省，環(huán)境的多態(tài)性使四川核桃的種質(zhì)資源十分豐富，形成了許多優(yōu)良的地方品種。自20世紀(jì)60年代開始，四川陸續(xù)從新疆、遼寧、云南等地引進(jìn)優(yōu)良品種，但由于氣候差異過大，北方和云南核桃品種在四川獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境中表現(xiàn)出環(huán)境適應(yīng)性不佳，落花落果嚴(yán)重等問題[2]?；诖?，育種工作者[2-5]利用云南的優(yōu)良品種與適應(yīng)于四川氣候的鄉(xiāng)土品種雜交獲得了一批早實(shí)優(yōu)良核桃品種，即‘川早’系列。近年來，越來越多的核桃品種通過四川省林木品種審定委員會(huì)的審(認(rèn))定并投入到生產(chǎn)中[6]，但在品種多樣化的同時(shí)，由于核桃嫁接技術(shù)的成熟和核桃苗木時(shí)期無法通過表型將親緣關(guān)系較近的品種區(qū)分開等原因，核桃品種在引種和推廣過程中“同物異名”或“同名異物”的情況時(shí)有發(fā)生。另外，由于缺乏準(zhǔn)確有效的苗木鑒定方法，也導(dǎo)致許多劣質(zhì)種苗以次充好流入市場，不僅嚴(yán)重影響了良種持有人和種植戶的利益，也嚴(yán)重影響了核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，建立一種有效的苗木品種鑒定的方法，對(duì)保證核桃種苗質(zhì)量和促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤為重要和迫切。

DNA分子標(biāo)記是一種新興的標(biāo)記技術(shù)，包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)、擴(kuò)增片段多態(tài)性(AFLP)、簡單重復(fù)序列標(biāo)記(ISSR)、簡單重復(fù)序列(SSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等都已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜繪制、雜交子代純度鑒定和遺傳多樣性評(píng)價(jià)等方面[7]。其中SSR標(biāo)記以其多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好等特點(diǎn)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于果樹的遺傳多樣性[8-10]、指紋圖譜構(gòu)建[11-12]、親緣關(guān)系[13]等方面的研究。近年來，SSR標(biāo)記在核桃方面的應(yīng)用主要集中在核桃居群遺傳結(jié)構(gòu)分析[14-15]、新型SSR標(biāo)記的開發(fā)[16-17]等方面，而在核桃優(yōu)良品種指紋圖譜構(gòu)建方面的研究較少，具體運(yùn)用到地方品種間的鑒定來指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐的研究更是鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)四川地區(qū)29個(gè)核桃良種進(jìn)行分析，構(gòu)建核桃品種指紋圖譜，分析品種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以期為核桃良種資源的鑒定和后續(xù)新品種的選育與審(認(rèn))定提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為四川省林木品種審定委員會(huì)審(認(rèn))定的29個(gè)核桃良種(表1)，包括四川本地選育的本地類型核桃品種18個(gè)(編號(hào)1～18)、雜交類型‘川早’系列5個(gè)(編號(hào)19～23)，經(jīng)過引種馴化的北方類型核桃品種5個(gè)(編號(hào)24～28)、云南類型品種1個(gè)(編號(hào)29)。29個(gè)核桃品種葉片于2017年4月上旬采自于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州基地，采樣時(shí)選擇新抽生的較嫩葉片，采集前用無水乙醇清洗消毒，采集后裝入自封袋中，再放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方 法

1.2.1基因組DNA的提取采用寶生物植物DNA提取試劑盒(TaKaRa, Dalian)提取核桃基因組DNA。提取的DNA利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量、超微量核酸蛋白測定儀(Nanodrop-2000)測定DNA濃度，將合格樣品濃度稀釋到25 μg/mL后放入-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2SSR擴(kuò)增參考史麗會(huì)等[18]選用的擴(kuò)增效果較好且穩(wěn)定的11對(duì)SSR引物(表2)應(yīng)用于試驗(yàn)中29個(gè)品種的PCR擴(kuò)增。熒光引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。SSR-PCR反應(yīng)體系為 25 μL，其中2 ×EsTaqMaster Mix(成都晶瑞思生物科技有限公司) 12.5 μL，Primer F和R引物(10 nmol·L-1)各1 μL，模板DNA(約25 ng·L-1)2 μL，最后用dd H2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55～60℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型分析。

1.2.3數(shù)據(jù)處理利用GeneMapper 4.0軟件對(duì)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并獲得擴(kuò)增片段大小，獲得的數(shù)據(jù)再根據(jù)GenAlEx 6.5軟件格式進(jìn)行轉(zhuǎn)換后，計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的基因型數(shù)(Ng)、觀察等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和香農(nóng)信息指數(shù)(I)；利用PIC計(jì)算程式(PIC-calc)計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC)。將擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成0、1二元數(shù)據(jù)，采用NTSYS-pc 2.1計(jì)算 Dice 遺傳相似性系數(shù)并進(jìn)行 UPGMA(非加權(quán)組平均法)聚類分析，繪制親緣關(guān)系樹狀圖。

表1 核桃品種名稱及選育來源

注：①原名‘遼核1號(hào)’；②原名‘香玲’；③原名‘遼核4號(hào)’；④原名‘新新2號(hào)’；⑤原名‘云新高原’

Note: ① original name ‘Liaohe 1’; ② original name ‘Xiangling’; ③ original name ‘Liaohe 4’; ④ original name ‘Xinxin 2’; ⑤ original name ‘Yunxingaoyuan’

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性

利用11對(duì)SSR熒光引物對(duì)29個(gè)核桃品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見表3。11對(duì)引物共檢測到80個(gè)等位基因，121個(gè)基因型，各引物等位基因數(shù)在5～12之間，基因型數(shù)在8～14之間，平均每對(duì)引物觀測等位基因數(shù)和基因型數(shù)分別為7.273和11個(gè)；有效等位基因數(shù)為2.499～4.485，均值為3.644；觀測雜合度為0.379～0.828，均值為0.645；期望雜合度為0.600～0.777，均值為0.718；香農(nóng)信息指數(shù)為1.171～1.859，均值為1.518；多態(tài)信息含量為0.560～0.750，均值為0.680。SSR引物均為高多態(tài)性引物(PIC> 0.5)，說明選用的SSR引物能夠較好地用于四川核桃品種遺傳多樣性分析。

表2 11對(duì)SSR引物信息

表3 11對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息

2.2 核桃遺傳圖譜

構(gòu)建林木品種DNA指紋圖譜比較常用的方法是引物組合法，即通過利用盡量少的引物組合來鑒別盡量多的品種，以達(dá)到簡單經(jīng)濟(jì)的目的。當(dāng)引物的PIC大于0.5時(shí)，表明采用的引物多態(tài)性較高、可供信息性較強(qiáng)。試驗(yàn)中選用的引物均為高多態(tài)性引物(PIC> 0.5)，均可作為指紋圖譜的核心引物，但為使指紋圖譜不冗余，利用最少引物組合將全部品種分開，試驗(yàn)綜合各項(xiàng)指標(biāo)分析，最終選擇等位基因數(shù)、基因型數(shù)較多，PIC較大的wga001、wga032和zmz22共3對(duì)引物的擴(kuò)增片段大小構(gòu)建29個(gè)核桃品種的指紋圖譜(表4)。表中以引物名稱加上擴(kuò)增片段大小作為品種的“指紋”，如‘薄殼早’在wga001位點(diǎn)的擴(kuò)增片段大小為184和188 bp。由表4可以看出，29個(gè)核桃品種的指紋圖譜互不相同，可用于后續(xù)品種的輔助鑒定。

2.3 遺傳相似性分析

利用NTSYS-pc2.1進(jìn)行遺傳相似系數(shù)計(jì)算，計(jì)算結(jié)果顯示29個(gè)核桃品種間的相似系數(shù)在0.580～0.914之間，平均為0.731。將品種間遺傳相似系數(shù)分為0.500～0.599、0.600～0.699、0.700～0.799、0.800～0.899、0.900～0.999等5個(gè)區(qū)間并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由圖1可知，遺傳相似系數(shù)在0.900～0.999區(qū)間的有1對(duì)(‘鹽源早’和‘薄殼早’)，為0.914；遺傳相似系數(shù)在0.500～0.599區(qū)間的有4對(duì)，其中最小的1對(duì)為0.580(‘清香’和‘客龍?jiān)纭?；29個(gè)核桃品種間的遺傳相似系數(shù)分布在0.700～0.799區(qū)間的最多，在0.600～ 0.699區(qū)間的次之，在0.800～0.899區(qū)間的較少；且在區(qū)間0.600～0.699和0.700～0.799的占到總數(shù)的86.9%，說明29個(gè)核桃品種間大多數(shù)親緣關(guān)系較近，且大多數(shù)品種間的相似系數(shù)變幅只有0.2，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄。

表4 各核桃品種的指紋圖譜

圖1 29個(gè)核桃品種間遺傳相似系數(shù)區(qū)間Fig.1 Genetic similarity coefficient range of 29 walnut cultivars

2.4 聚類分析

29個(gè)核桃品種間遺傳相似系數(shù)為0.580～0.914，平均為0.731。其中來自阿壩州黑水縣的品種‘客龍?jiān)纭捅狈揭N的‘清香’核桃遺傳相似系數(shù)最小，為0.580，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；來自阿壩州黑水縣的‘薄殼早’和來自涼山州鹽源縣的‘鹽源早’遺傳相似系數(shù)最大，為0.914，親緣關(guān)系最近。對(duì)29個(gè)核桃品種進(jìn)行UPGMA聚類結(jié)果如圖2，對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行Cophenetic相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)r= 0.727，表明聚類結(jié)果較好。以遺傳相似系數(shù)0.66為閾值，29個(gè)核桃品種可分為2個(gè)類群，其中從云南引種的‘蜀江2號(hào)’單獨(dú)聚為1個(gè)類群(Ⅱ)，另外28個(gè)品種聚為1個(gè)類群(Ⅰ)，表明云南類型品種‘蜀江2號(hào)’與其他類型的品種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以遺傳相似系數(shù)0.73為閾值，可以將第Ⅰ類群分為6個(gè)組；a組包括‘巴山烏米籽1號(hào)’、‘通核0147’、‘青川1號(hào)’、‘南核1號(hào)’、‘威薄01’、‘石坎紫皮’、‘梓森早核’、‘蜀苑4號(hào)’、‘珍珠核桃’、‘通核0114’、‘南核1號(hào)’、‘通核0046’共12個(gè)四川本地類型品種及‘川早1號(hào)’、‘川早2號(hào)’和‘蜀玲’共3個(gè)雜交類型核桃品種；b組包括‘客龍?jiān)纭ⅰê?035’和‘蜀苑3號(hào)’共3個(gè)本地類型品種及‘林萍-1’和‘川香’共2個(gè)引自北方類型品種；c組包括2個(gè)親緣關(guān)系最近的本地類型品種‘薄殼早’和‘鹽源早’；d組引自北方類型品種‘川核早’單獨(dú)聚為1組；e組包括2個(gè)引自北方類型品種‘南福1號(hào)’和‘清香’及1個(gè)本地類型品種‘七曲山核桃’；f組包括2個(gè)雜交類型品種‘雙早’和‘早豐’?？傮w來看，29個(gè)核桃品種根據(jù)品種類型優(yōu)先聚類，即第Ⅰ類群的a、c組主要是四川本地類型核桃，b、d、e組主要是北方引進(jìn)品種，f組是2個(gè)雜交類型品種單獨(dú)聚類，第Ⅱ類群的云南核桃單獨(dú)聚類；四川本地類型品種的聚類結(jié)果表現(xiàn)出與地理來源沒有明顯的相關(guān)性。

圖2 基于SSR標(biāo)記的29個(gè)品種的UPGMA聚類圖Fig.2 Clustering figure (UPGMA) of 29 walnut varieties based on SSR markers

3 討 論

中國核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展最嚴(yán)重的問題之一是品種混雜[19-20]。目前，中國核桃品種的鑒定領(lǐng)域仍然是以表觀性狀與經(jīng)濟(jì)性狀為主，其中以2011年制定的《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南——核桃屬》標(biāo)準(zhǔn)最具權(quán)威性。但在品種多樣化的同時(shí)，有些親緣關(guān)系較近的核桃品種僅靠表型性狀很難準(zhǔn)確區(qū)分，因此能夠反映植物DNA水平變異且具有多態(tài)性、高效性等特點(diǎn)的SSR分子標(biāo)記已逐漸運(yùn)用于核桃的品種鑒定研究中[21]。陳凌娜[22]利用12對(duì)SSR引物對(duì)35個(gè)北方主栽核桃品種進(jìn)行了DNA分型分析發(fā)現(xiàn)，12對(duì)引物的PIC含量變幅為0.53～0.87，平均為0.73，4對(duì)引物結(jié)合就能將供試的35個(gè)品種分開，充分體現(xiàn)了SSR標(biāo)記用于鑒定的高效性。本研究中，11對(duì)多態(tài)性引物對(duì)四川29個(gè)核桃品種擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅使用其中3對(duì)SSR引物組合(wga001、wga032、zmz22)即可將29個(gè)核桃品種完全分開，引物的可鑒定性較強(qiáng)。另外，本研究所采用的11對(duì)引物均為高多態(tài)性引物(PIC> 0.5)，可供信息性較強(qiáng)，可運(yùn)用于以后的四川核桃遺傳多樣性研究。

基于11個(gè)SSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果顯示，29個(gè)核桃品種根據(jù)品種類型優(yōu)先聚類，第Ⅰ類群的a組基本上是四川本地的鄉(xiāng)土核桃品種，還包括‘川早1號(hào)’、‘川早2號(hào)’和‘蜀玲’3個(gè)雜交類型核桃品種。這一結(jié)果與高源等[23]和張瑞萍等[24]利用SSR技術(shù)對(duì)蘋果種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析中栽培品種和當(dāng)?shù)仄贩N及野生品種聚在一起的情況類似。這可能與3個(gè)雜交核桃品種的父本是四川本地的核桃品種[2]，攜帶的四川本地核桃血統(tǒng)較多有關(guān)。b組、d組主要是從北方引進(jìn)的核桃品種，而‘客龍?jiān)纭?、‘蜀?號(hào)’、‘通核0035’和‘七曲山核桃’4個(gè)鄉(xiāng)土核桃品種與其聚在一起，親緣關(guān)系較近，可能與四川引進(jìn)北方品種歷史較長，本地核桃與北方核桃進(jìn)行了廣泛的基因交流，而這幾個(gè)品種可能是從北方核桃與本地核桃種質(zhì)資源自然雜交后代中選育出來的有關(guān)。f組的2個(gè)雜交核桃品種聚為1組，親緣關(guān)系較近，可能是‘雙早’和‘早豐’的父本和母本都一致的緣故，而母本相同的‘川早’系列的5個(gè)品種沒有完全聚在一起，可能是因?yàn)椤ㄔ纭盗械母副臼潜镜睾颂?，母本是‘云南云新’系列[2-5]，兩者的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，子代間存在一定的遺傳分化。本研究還發(fā)現(xiàn)，四川本地核桃品種的聚類結(jié)果與選育的地理來源沒有直接的相關(guān)關(guān)系：來源相同且親緣關(guān)系較近的品種只有1對(duì)，即來自綿陽的‘梓森早核’與‘石坎紫皮’；親緣關(guān)系最近的‘薄殼早’和‘鹽源早’地理選育來源較遠(yuǎn)；還有一部分來自同一選育來源地的幾個(gè)品種分散在幾個(gè)組中。這與張明澤等[25]對(duì)黔南茶樹種質(zhì)資源的研究結(jié)果類似，可能與四川核桃廣泛引種交流導(dǎo)致一部分優(yōu)良基因在不同地區(qū)滲入有關(guān)[25-27]。

遺傳相似系數(shù)是判斷品種間親緣關(guān)系及遺傳基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)之一。遺傳相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)的變幅越大，供試材料的遺傳基礎(chǔ)越寬[27-28]。本研究中29個(gè)核桃品種間遺傳相似系數(shù)為0.580～0.914，變幅為0.334，且處于0.600～0.799區(qū)間內(nèi)的占到86.9%。因此，供試的29個(gè)品種親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較窄。這與陳良華等[29]對(duì)四川核桃遺傳多樣性研究得出的四川4個(gè)野生核桃群體的遺傳相似性較大的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，母本和父本都相同且遺傳距離較遠(yuǎn)的四川鄉(xiāng)土核桃品種和云南核桃雜交的‘川早’系列(‘川早1號(hào)’、‘蜀玲’、‘早豐’)在聚類時(shí)并未聚在一起，而且遺傳相似系數(shù)相對(duì)較小，遺傳變異較大，雜種優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)。因此，建議以后四川核桃品種選育多利用雜交育種方法，并盡量選擇遺傳距離較遠(yuǎn)的親本。