杜吉革，薛 麒，朱 真，彭小兵，張秀坤，李啟紅，印春生，姚文生，康 凱，陳小云

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的人畜共患菌，能引起人類以及多種家畜家禽發(fā)病[1]，不僅威脅著人類的健康，而且對畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，并通過其產(chǎn)生的毒素發(fā)揮致病作用[3]。根據(jù)產(chǎn)生4種主要致死性外毒素α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)的種類，可將該菌分為A、B、C、D、E五個毒素型[3]。其中，對養(yǎng)牛業(yè)危害最大的是A、C和D型。在國外，牛的產(chǎn)氣莢膜梭菌病以C、D型菌導(dǎo)致牛的壞死性腸炎或腸原性毒血癥為主，而在國內(nèi)，牛的產(chǎn)氣莢膜梭菌病則以A型菌導(dǎo)致的牛“猝死癥”為主[4]。病牛往往無任何前驅(qū)癥狀，而突然發(fā)作死亡[4-5]。因此，疫苗免疫是防制該病的有效手段。然而，國內(nèi)還沒有商品化的疫苗來預(yù)防牛的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病。在預(yù)防羊的產(chǎn)氣莢膜梭菌病方面，雖然產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗，起到了一定的效果，但該類疫苗是通過滅活細菌培養(yǎng)物上清而制備的天然類毒素，制備過程冗雜，抗原成分復(fù)雜，有效抗原量較低。如大劑量的肌肉注射會破壞牛肉的品質(zhì)。因此，提供安全、純凈、有效的抗原對未來預(yù)防該菌感染具有重要意義。

CPA是由產(chǎn)氣莢膜梭菌染色體基因plc編碼[6]，該基因存在于五個毒素型的菌株中，但在A型毒株中表達水平最高[7]。CPA分為N-末端(1-246，簡稱CPAN)和C-末端(247-370)兩個結(jié)構(gòu)域。其中，CPAN是CPA發(fā)揮酶活性的主要區(qū)域，而CPAC是毒素與細胞結(jié)合的主要區(qū)域[8]。研究表明，重組CPA仍存在一定的毒力[9]，而通過甲醛滅活后的天然CPA抗原性會明顯降低[10-11]。為此，無毒力CPA的研制具有重要的意義。已有的研究證實，CPAC能夠?qū)μ烊籆PA起到一定的免疫保護作用[12-14]。此外，Alison等[15]篩選出一株在體內(nèi)和體外實驗中對CPA均具有中和保護作用的單抗，進一步的研究證實，該單抗針對的線性表位NE的氨基酸序列是ARGFAK，位于CPA的第193～198位。由于CPAC蛋白分子量較小，研究者通常選擇將CPAC與GST等大分子量標簽蛋白融合表達，從而引入了過多無關(guān)的抗原成分[13-14]。為了更好發(fā)揮CPAC和NE的免疫保護作用，試驗根據(jù)我國現(xiàn)行A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標準株(C57-1株)CPAC和NE的編碼序列進行密碼子優(yōu)化設(shè)計，并將上述兩種基因序列分別進行3次重復(fù)后串聯(lián)，經(jīng)原核系統(tǒng)表達、純化和鑒定，并對重組蛋白的免疫保護性進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、實驗動物和試劑 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1株天然毒素、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清及pET30a(+)(以下簡稱pET)表達載體均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障處微生物實驗室保存；1.5～2.0 kg普通級健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細胞Top10和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；佐劑Montanide ISA 201購自法國seepic公司；蛋白Marker(M1)、Western blot Marker(M2)、Ni-IDA親和層析介質(zhì)試劑盒，購自金斯瑞生物科技有限公司；高保真PCR酶KOD購自東洋坊；premix taq version 2.0，購自takara；T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密碼子優(yōu)化 以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-1 的CPAC和NE3編碼基因序列為模版進行優(yōu)化設(shè)計，將二者的3拷貝序列串聯(lián)后，在串聯(lián)基因的3'端添加6*His標簽蛋白的編碼序列，由中美泰和公司合成基因片段GCPAC3NE3。

1.3 原核表達載體的構(gòu)建 以人工合成的片段為模板，采用引物對1F/1R進行PCR擴增。其中上游引物1F序列為：5'-GGCGGATCCGTTGGTAAGAAC-3'，其5'端引入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基；下游引物1R序列為：5'-GGCCTCGAGTTAGTGGTGATGGT及保護性堿基，其5'端引入限制性內(nèi)切酶XhoⅠ位點(下劃線部分)。PCR體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共33個循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。

回收目的條帶，采用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，與經(jīng)過相同酶切處理的pET連接。將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的質(zhì)粒送中美太和公司測序，將測序正確的質(zhì)粒命名為pCPAC3NE3。

1.4 重組蛋白的表達與純化 將pCPAC3NE3以及pET轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞中，分別在15 ℃和37 ℃條件下用IPTG誘導(dǎo)表達，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，并采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，對重組蛋白做進一步的鑒定。對以包涵體形式表達的蛋白進行進一步的純化和復(fù)性，具體方法見文獻[2]。

1.5 rCPAC3NE3與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清的反應(yīng) rCPAC3NE3經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)上，以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗進行孵育，按照底物顯色試劑盒說明書進行顯色。

1.6 抗原性分析

1.6.1 免疫程序 選用對A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的中和效價為0的家兔，進行重組蛋白的免疫，具體免疫方法和程序見文獻[2]。

1.6.2 血清中和效價測定 采用血清中和的方法測定兔血清的毒素中和效價，具體操作方法見文獻[2]。

1.6.3 攻毒試驗 二免后21d，用1個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素進行攻毒，具體的免疫程序見文獻[2]，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結(jié) 果

2.1 CPAC3NE3串聯(lián)基因的原核表達載體的成功構(gòu)建

采用引物1F/1R進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)酶切后克隆至pET載體上。獲得重組質(zhì)粒的雙酶切電泳結(jié)果如圖1所示，酶切后出現(xiàn)大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約1203 bp的目的基因片段，與預(yù)期相符。測序結(jié)果表明，插入的外源基因序列正確，將此質(zhì)粒命名為pCPAC3NE3。

2.2 CPAC3NE3串聯(lián)基因的原核表達與純化 將pCPAC3NE3及pET分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示，在15 ℃誘導(dǎo)16 h和37 ℃誘導(dǎo)4 h 兩種條件下表達的重組蛋白均以包涵體的形式表達，分子量約為55 kD，且均能與抗His標簽抗體發(fā)生反應(yīng)，與預(yù)期相符(圖2)。綜合考慮蛋白表達量和誘導(dǎo)時間，選擇37 ℃誘導(dǎo)4 h的條件進行后續(xù)的誘導(dǎo)。如圖3所示，按照Ni-IDA瓊脂糖凝膠說明書對重組蛋白進行純化，收集純度較高的Lane11-12洗脫液進行透析和復(fù)性，最終獲得的rCPAC3NE3蛋白濃度為0.671 mg/mL。

a:重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定；b:重組蛋白與抗His單抗反應(yīng)的Western blotM1: 蛋白Marker；M2: Western blot Marker；PC1: BSA (1 μg)；PC2: BSA (2 μg)；pET: pET 37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物;1: pCPAC3NE3，15 ℃、16 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；2: pCPAC3NE3，37 ℃、4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物；pET1: pET 37 ℃ 4 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清;pET2: pET 37 ℃ 4 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀；3: pCPAC3NE3 15℃ 16 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；4: pCPAC3NE3 15 ℃ 16 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀;5: pCPAC3NE3 37 ℃ 4 h誘導(dǎo)的細胞裂解上清；6: pCPAC3NE3 37 ℃ 4 h誘導(dǎo)的細胞裂解沉淀a.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b: The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot M1: protein Marker;M2: Western blot Marker；PC1: BSA (1 μg);PC2: BSA (2 μg);pET: The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 1: The cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2: The cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;pET1:The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;pET2:The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 3:The supernatant of cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4: The precipitation of cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 5: The supernatant of cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;6: The precipitation of cell lysates of pCPAC3NE3 induced with IPTG for 4 h at 37 ℃圖2 rCPAC3NE3的原核表達與鑒定Fig 2 Prokaryotic expression and identification of rCPAC3NE3

M:蛋白Marker; 1:包涵體溶解離心后上清;2:上清同Ni-IDA孵育后流出液；3-10:50 mmol/L Imidazole的洗脫液;11-12:100 mmol/L Imidazole的洗脫液；13:300 mmol/L Imidazole的洗脫液M: protein Marker; 1: The supernatant of dissolved inclusion bodies; 2: The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;3-10: The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 50 mmol/L Imidazole); 11-12: The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 100 mmol/L Imidazole);13: The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer contain 300 mmol/L Imidazole)圖3 rCPAC3NE3的純化Fig 3 Purification of CPAC3NE3

2.3 rCPAC3NE3與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清的鑒定 rCPAC3NE3經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到NC膜上進行Western blot，結(jié)果如圖4所示，rCPAC3NE3與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗血清發(fā)生明顯反應(yīng)。

M: 蛋白Marker；1. pET 37 ℃ 4 h誘導(dǎo)的細胞裂解物;2: 純化后的rCPAC3NE3M: Protein Marker; 1: The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;2: rCPAC3NE3 after purification圖4 rCPAC3NE3與A型產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素血清的反應(yīng)Fig 4 Interaction of rCPAC3NE3 with antitoxin serum of Clostridium perfringens type A

2.4 rCPAC3NE3的免疫原性分析

2.4.1 抗rCPAC3NE3兔血清的毒素中和抗體效價測定

經(jīng)血清中和法測定，以rCPAC3NE3免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和40個MLD的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和80個MLD的A 型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對毒素?zé)o中和作用。

2.4.2 rCPAC3NE3免疫對兔的免疫保護結(jié)果 在二免后21 d，對所有rCPAC3NE3免疫組和對照組的家兔，經(jīng)耳緣靜脈注射1個MLD的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌天然毒素，結(jié)果對照組家兔在攻毒后5 d內(nèi)全部死亡，rCPAC3NE3免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應(yīng)，保護率達100%。

3 討 論

隨著研究的深入，與產(chǎn)氣莢膜梭菌密切相關(guān)的主要致死性外毒素的結(jié)構(gòu)和致病機理越來越清晰，致死性外毒素的部分無毒區(qū)域(CPA、CPB以及CPI的C末端)或者無毒突變體(ETX 和θ毒素(PFO)[2])作為亞單位疫苗抗原已經(jīng)被證實能夠有效地中和相應(yīng)的毒血癥。作為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致死性毒素，CPA的減毒乃至無毒研究工作成為了眾多研究者的方向。雖然對CPA發(fā)揮功能的關(guān)鍵氨基酸位點進行單點突變能夠?qū)崿F(xiàn)減毒的目的[16-18]，但這些突變體的免疫原性還沒有得到充分的研究。此外，單個氨基酸突變的CPA在未來基因工程疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中存在一定的生物安全隱患。對CPA的兩個區(qū)域免疫保護性分析的結(jié)果表明，單獨的CPAC具有一定的免疫保護作用，而單獨的CPAN卻無免疫保護作用。然而，針對CPA第193～198位氨基酸的單抗已被證實具有良好的中和保護作用，而該表位則處于CPAN內(nèi)[15]。這可能由于單獨的CPAN分子量過小，用與GST融合的蛋白免疫動物，實際的抗原量不足。為此，試驗將CPAC和線性表位NE分別進行3次重復(fù)后串聯(lián)進行融合表達，不僅增加了有效抗原量，也增加抗原蛋白整體的分子量，更有利于增強抗原蛋白的抗原性。

對非可溶形式表達的重組蛋白進行純化和復(fù)性后獲得rCPAC3NE3，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，rCPAC3NE3具有較好的免疫原性。在實際生產(chǎn)中，以包涵體形式表達的重組蛋白在純化中可顯著降低產(chǎn)物中內(nèi)毒素的含量，這是rCPAC3NE3作為制備疫苗用抗原的優(yōu)勢之一。然而，在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)可溶性表達的重組ETX免疫原性明顯高于非可溶性表達的重組蛋白。為此，如何提高rCPAC3NE3的可溶性表達量并驗證其免疫原性，將是后續(xù)研究的重要方向。