王 勛，米吉提·莫合他爾汗，孫明軍，狄棟棟，許 芳，賈舒安，顏成旭，李金平，范偉興，曾巧英*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070；2.新疆動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，烏魯木齊830000；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032)

布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病。在目前已知的6個(gè)經(jīng)典布魯氏菌種中[1]，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)造成重大危害并能引起人致病的主要為羊種布魯氏菌(B.melitensis)[2]，其次是牛種布魯氏菌(B.abortus)和豬種布魯氏菌(B.suis)[3]。而羊種布魯氏菌三個(gè)生物型(1、2、3型)中，最常見的是生物3型，占整個(gè)羊種分離菌株的80%以上。布魯氏菌在遺傳上高度保守，而我國(guó)流行菌株的種型相對(duì)單一，因而，建立一個(gè)分辨力高的布魯氏菌鑒別方法對(duì)布病流行病學(xué)調(diào)查尤其是病原追溯是非常必要的。

由于傳統(tǒng)的布魯氏菌種型鑒定方法過程繁瑣、人員感染風(fēng)險(xiǎn)較高，因而以核酸分子為基礎(chǔ)的基因型分析方法越來越受到重視。多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multi-locus VNTR Assay，MLVA)和多位點(diǎn)序列分析(multi-locus sequence analysis，MLSA)是目前國(guó)際上主要的布魯氏菌分子分型方法?；?6個(gè)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(Variable-Number of Tandem-Repeats，VNTR)位點(diǎn)的MLVA分型方法(MLVA-16)具有較高的分辨力且最為常用[3-4]，可用于地域關(guān)系比較遠(yuǎn)的布魯氏菌分離株的鑒別和遺傳關(guān)系分析，但對(duì)于遺傳關(guān)系較近的菌株區(qū)分能力較弱；包含21個(gè)看家基因的MLSA分型方法(BruMLSA21)對(duì)不同種的布魯氏菌菌株具有很好的區(qū)分能力[5-7]，但對(duì)于同一種型的布魯氏菌的區(qū)分能力還是很低。我國(guó)布魯氏菌流行菌株的種型單一且遺傳同源性較高，MLVA-16和BruMLSA21的大部分位點(diǎn)在我國(guó)分離菌株中沒有多態(tài)性或者僅呈現(xiàn)有限的多態(tài)性[2,8]，對(duì)菌株區(qū)分能力較弱，無法滿足布病流調(diào)中對(duì)病原追溯的需求。因而，有必要建立一個(gè)分辨率高的、適合我國(guó)布魯氏菌遺傳特性的分型方法，為我國(guó)布病分子流行病學(xué)調(diào)查和分析菌株間遺傳關(guān)系提供支持。

1 材料與方法

1.1 VNTR位點(diǎn)選擇和引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已有文獻(xiàn)[3,9]，對(duì)95個(gè)已知布魯氏菌VNTR位點(diǎn)進(jìn)行重新篩選和評(píng)價(jià)。VNTR篩選依據(jù)包括：(1)所有位點(diǎn)在牛種、羊種和豬種布魯氏菌參考菌株(B.melitensis16M,B.abortus2308和B.suis1330)中都存在；(2)在同一PCR反應(yīng)條件下，所有VNTR位點(diǎn)都能有效擴(kuò)增；(3)VNTR位點(diǎn)在布魯氏菌基因組中均勻分布；(4)為了方便檢測(cè)，擴(kuò)增片短長(zhǎng)度在100～ 600 bp 之間，特異性高，無其他非特異性帶。布魯氏菌參考菌株的基因組由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；PCR有關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司(Takara)。

1.2 與傳統(tǒng)的MLVA-16分型方法的比較 利用我國(guó)分離的51株羊種布魯氏菌分離菌株(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心人獸共患病監(jiān)測(cè)室提供)對(duì)不同MLVA分型方法進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。這些菌株分別來自我國(guó)新疆、山東、甘肅、河南、河北五省的不同地市，分離時(shí)間為2010-2016年，具有一定的代表性，分離方法見文獻(xiàn)[6]。通過PCR和毛細(xì)管電泳方法來確定各菌株每個(gè)VNTR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量，根據(jù)分子量大小計(jì)算VNTR位點(diǎn)的重復(fù)單元數(shù)。用Hunter-Gaston Diversity(HGDI)指數(shù)對(duì)每個(gè)VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行分析(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICI.pl)。應(yīng)用BioNumerics 7.6軟件對(duì)菌株之間的親緣關(guān)系進(jìn)行聚類分析。細(xì)菌基因組提取試劑盒由寶生物工程有限公司(Takara)提供。

1.3 與BruMLSA21分型的比較 利用上述51株羊種布魯氏菌分離菌株，參照Sun M J方法[8]對(duì)21個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與BrucellaMLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)(https://pubmlst.org/Brucella/)，對(duì)出現(xiàn)的新等位基因給定一個(gè)獨(dú)特的數(shù)值，在21個(gè)基因位點(diǎn)上只要有一個(gè)新的等位基因則定義為一個(gè)新的序列型。21個(gè)位點(diǎn)的序列組裝連接后，利用MEGA 5.1軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 MLVA分型方法的優(yōu)化 通過對(duì)布魯氏菌VNTR位點(diǎn)進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)，其中47個(gè)VNTR位點(diǎn)符合要求，刪除多態(tài)性位點(diǎn)相近的位點(diǎn)，最終選擇了15個(gè)VNTR位點(diǎn)(I號(hào)染色體10個(gè)，Ⅱ號(hào)染色體5個(gè))，作為一個(gè)新的MLVA分型方法-MLVA-15，各VNTR位點(diǎn)的引物、重復(fù)片段長(zhǎng)度、PCR產(chǎn)物大小與重復(fù)片段拷貝數(shù)等信息見表1。與傳統(tǒng)的MLVA-16分型方法相比，MLVA-15分型方法保留了其中8個(gè)VNTR位點(diǎn)(Bruce04、Bruce09、Bruce16、Bruce30、Bruce42、Bruce43、Bruce45 和Bruce55)，另外又包括了7個(gè)未被使用的位點(diǎn)(Bruce13、Bruce15、Bruce17、Bruce24、Bruce72、BruceVNTR1和BruceVNTR25)。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 5 min預(yù)變性；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 MLVA-15 VNTR位點(diǎn)信息表Tab 1 Information of VNTRs in MLVA-15

2.2 MLVA-15與MLVA-16分型方法的比較 對(duì)51株我國(guó)羊種布魯氏菌分離菌株MLVA-15 VNTR位點(diǎn)的多態(tài)性分析結(jié)果顯示，除了Bruce45和Bruce55 2個(gè)VNTR位點(diǎn)，其他所有位點(diǎn)均呈現(xiàn)不同程度的多態(tài)性(HGDI=0.077～0.887)(表2)。其中，Bruce04、Bruce24、Bruce30和BruceVNTR1 4個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性最高(HGDI=0.718～0.887)，其余9個(gè)位點(diǎn)具有中等或較低的多態(tài)性(HGDI=0.077～0.645)。MLVA-15分型方法對(duì)菌株的區(qū)分能力明顯提高，51株布魯氏菌分為51個(gè)基因型，對(duì)菌株的鑒別效率達(dá)到100%(圖1)。MLVA-16分型方法僅鑒定出28個(gè)基因型，對(duì)菌株的區(qū)分效率為55%，顯著低于MLVA-15(圖2)。對(duì)于菌株之間的遺傳關(guān)系分析，MLVA-15分型方法與MLVA-16分型方法獲得的聚類結(jié)果基本一致，具有相同MLVA-16基因型的5個(gè)菌株(Bruxj20、Bruxj35、Bruxj99、GS1683和GS1692)在MLVA-15聚類圖上也聚為一簇(圖1、圖2)，表明MLVA-15分型方法不會(huì)對(duì)以往MLVA-16分析遺傳關(guān)系的結(jié)果產(chǎn)生較大的改變。

表2 MLVA-15各VNTR位點(diǎn)在51株布魯氏菌中的多態(tài)性Tab 2 Genetic diversity of MLVA-15 VNTRs in 51 B. melitensis isolates

2.3 MLVA-15與BruMLSA21分型方法的比較 對(duì)21個(gè)基因的測(cè)序結(jié)果表明，51株羊種布魯氏菌菌株共發(fā)現(xiàn)4個(gè)序列型(Sequence type, ST)，分別為ST8、ST137、ST138和ST139。其中37株屬于ST8，ST139菌株也比較常見(12株)，ST138和ST137僅有1株。4個(gè)序列型之間的差異很小，是由三個(gè)基因的單核苷酸突變引起的，表明我國(guó)羊種布魯氏菌流行株在遺傳上是十分保守的(表3)。

表3 51株羊種布魯氏菌流行株序列型分析Tab 3 ST designation of 51 B.melitensis strains

3 討論與小結(jié)

以MLVA和MLSA為主的分子分型方法在分析布魯氏菌變異程度和遺傳關(guān)系上起到重要作用。MLVA利用布魯氏菌基因組中的VNTR位點(diǎn)來研究布魯氏菌遺傳多態(tài)性，因?yàn)椴煌截悢?shù)的重復(fù)序列經(jīng)常出現(xiàn)在不同種或同一個(gè)種的不同株、型之間。其中，MLVA-16分型方法最為常用[10-11]。該法包括16個(gè)VNTR位點(diǎn)，分為Panel 1和Panel 2兩組。Panel1的8個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性較低，僅用于遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株的鑒別，尤其是布魯氏菌在種水平上的鑒別。Panel2的8個(gè)位點(diǎn)具有中等或較高的遺傳多態(tài)性，適用于遺傳關(guān)系較近的同種(或生物型)菌株的鑒別[4,9]。這種VNTR位點(diǎn)組合可以分析流行菌株之間的差異和遺傳關(guān)系，但對(duì)國(guó)內(nèi)當(dāng)前布魯氏菌流行菌株的鑒別能力略顯不足。對(duì)于國(guó)內(nèi)羊種布魯氏菌，16個(gè)VNTR位點(diǎn)僅有3個(gè)位點(diǎn)(Bruce04、Bruce16、Bruce30)具有較高多態(tài)性，1個(gè)位點(diǎn)(Bruce43)具有中等多態(tài)性，其余12個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性很低或沒有任何多態(tài)性。研究建立的MLVA-15方法減少了MLVA-16中8個(gè)不具有多態(tài)性的位點(diǎn)，增加了7個(gè)多態(tài)性較高的位點(diǎn)，提高了對(duì)布魯氏菌流行菌株的鑒別能力，可以滿足布病流行病學(xué)調(diào)查中對(duì)傳染源和傳播途徑精確追溯的需求。

右側(cè)數(shù)據(jù)依次為菌株分離地點(diǎn)、名稱、生物型和分離時(shí)間Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date圖1 51株我國(guó)羊種布魯氏菌MLVA-15聚類分析結(jié)果Fig 1 MLVA-15 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

右側(cè)數(shù)據(jù)依次為菌株分離地點(diǎn)、名稱、生物型和分離時(shí)間Right columns represents isolation location, names, biotype and isolation date圖2 51株我國(guó)羊種布魯氏菌MLVA-16聚類分析結(jié)果Fig 2 MLVA-16 cluster analysis on 51 B.melitenis isolates

BruMLSA21分型是利用布魯氏菌21個(gè)看家基因的單核苷酸多態(tài)性來區(qū)分菌株的方法，核苷酸序列變異也可反映菌株之間的進(jìn)化關(guān)系。BruMLSA21分析表明，我國(guó)大部分羊種布魯氏菌流行株屬于ST8，同時(shí)還存在一些不常見的序列型。BruMLSA21與BruMLSA9相比(僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因型ST8)[7]，對(duì)菌株區(qū)別能力大有提高，但與傳統(tǒng)的MLVA-16和新建立的MLVA-15分型方法相比，對(duì)菌株的分辨能力還是很低。盡管增加基因個(gè)數(shù)或長(zhǎng)度可以增加其分辨力，但同時(shí)也增加了測(cè)序成本，不適合推廣使用。因?yàn)橛腥蚧臄?shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmlst.org/)，便于各國(guó)分離菌株之間的比較，BruMLSA21在分析各國(guó)布魯氏菌菌株的遺傳多態(tài)性以及進(jìn)化分析方面仍具有參考意義[8,12]。

除了MLVA和BruMLSA21，基于全基因組測(cè)序的SNP分型方法(WGS-SNPs based typing)對(duì)布魯氏菌菌株具有極高的辨別能力，也開始用于我國(guó)布魯氏菌流行菌株的遺傳多態(tài)性和進(jìn)化關(guān)系分析[13]，但是由于檢測(cè)成本較高，該方法目前使用較少。因而在未來的一段時(shí)期，基于不同VNTR位點(diǎn)組合的MLVA分型技術(shù)仍將在布魯氏菌的分離鑒定及遺傳關(guān)系分析方面發(fā)揮重要作用。