崔娟，喜多島敏彥，王寧，中西秀樹，高曉冬

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要環(huán)節(jié)，糖鏈對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的影響[1]。目前在醫(yī)藥用的蛋白中，70%以上都是糖蛋白。藥用糖蛋白表面的糖鏈具有改善藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，增強藥物的靶向性等功能[2]。然而，目前生產(chǎn)出來的重組藥用糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的非均一性造成了藥效下降及批次間不一致，甚至產(chǎn)生免疫副反應，這些都嚴重影響了藥用糖蛋白的臨床應用[3]。因此，如何生產(chǎn)糖鏈結(jié)構(gòu)均一的糖蛋白十分重要[4]。

目前糖苷內(nèi)切酶催化的轉(zhuǎn)糖基作用對于生產(chǎn)均一糖鏈的糖蛋白是一種重要的手段。ENGase(EC 3.2.1.96)是一種糖苷內(nèi)切酶，可以水解N糖鏈上2個N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，分為糖苷水解酶18家族(glycoside hydrolase families 18, GH18)和GH85。屬于GH18的ENGase具有糖苷水解活性，例如來源于褶皺鏈霉菌(Streptomycesplicatus)的Endo-H[5]和來源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Endo-S[6]等。屬于GH85的ENGase除了水解活性之外同時還具有轉(zhuǎn)糖基活性，可以將均一化的糖鏈轉(zhuǎn)移到糖蛋白上的β-N-乙酰氨基葡萄糖上，在2個GlcNAc之間形成新的均一化糖鏈從而應用到生產(chǎn)均一糖鏈的糖蛋白上，例如來源于原生節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)的Endo-A[7]和來源于凍土毛霉(Mucorhiemalis)的Endo-M[8]等。

目前Endo-A和Endo-M已經(jīng)被廣泛應用于均一化糖鏈糖蛋白的合成，但Endo-A只能利用高甘露糖型糖鏈作為糖基供體，Endo-M雖然可以利用高甘露糖型、復合型以及雜合型N-糖鏈，已經(jīng)被商業(yè)化利用，但是由于其難以從大腸桿菌中大量純化，導致價格昂貴[9]。通常ENGase的水解活性要比轉(zhuǎn)糖基活性高，合成產(chǎn)物容易被自身再次水解，導致產(chǎn)率降低。而且不同的ENGase由于其底物特異性不同，使用范圍受到限制。為了克服這些問題，該研究尋找到一種新的來源于布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的ENGase，可以在大腸桿菌中大量表達和純化，通過檢測水解活性以及底物特異性，融合蛋白Nus-Endo Tb能夠作用于高甘露糖型和復合型糖鏈。并且用唾液酸糖肽作為糖基供體，檢測到 Nus-Endo Tb具有轉(zhuǎn)糖基活性。由于Nus-Endo Tb可以在大腸桿菌中大量表達和簡單的純化，并且酶的性質(zhì)穩(wěn)定利于儲存，在對于N糖蛋白修飾的研究中有一定的實用價值。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS購于博邁德公司；質(zhì)粒pET43a-10His-Nus由實驗室前期構(gòu)建；用于擴增基因的引物在華大基因合成。

1.2 表達載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb的構(gòu)建

以布氏錐蟲基因組作為模板，使用正向引物ETb-Fw0和反向引物ETb-Rv0對其進行PCR擴增，獲得Endo-Tb的基因片段。用XhoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)分別對基因片段和質(zhì)粒pBluescript II SK(+)進行雙酶切，經(jīng)Ligation-Mix連接酶(TaKaRa)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于LB卡那抗性平板。挑選單菌落進行菌落PCR和限制性酶切的初步鑒定，將獲得的陽性克隆送至上海六合華大基因測序，從而得到正確編碼的載體pBS-EndoTb。然后以pBS-EndoTb為模板，分別使用FL-43、D1-43、D2-43為正向引物，Rv-43為反向引物，擴增3個不同長度的基因片段，用EcoRI和XhoI分別對基因片段和質(zhì)粒pET43a-10His-Nus進行雙酶切。連接轉(zhuǎn)化后涂布于LB氨芐抗性平板。鑒定后得到正確編碼的載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb(FL)、pET43a-10His-Nus-Endo Tb(D1)和pET43a-10His-Nus-Endo Tb(D2)。構(gòu)建質(zhì)粒所用的引物在表1中列出。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 Nus-Endo Tb在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中的表達和純化

將重組表達載體pET43a-10His-Nus-Endo Tb(FL/D1/D2)分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS，挑取單菌落接種至5 mL LB氨芐液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，將菌液轉(zhuǎn)接至新的LB培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，16 ℃培養(yǎng)過夜。收集100 mL菌液，重懸于20 mL平衡緩沖液A(18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，pH 7.4)，置于冰上超聲破碎后14 000 r/min離心30 min收集上清。使用蛋白純化系統(tǒng)AVANT(AKTA)純化上清中蛋白。首先，用平衡緩沖液A平衡親和層析柱HisTrpTMHP，上樣之后分別用含有12%、20%、40%、100%的洗脫緩沖液B(18 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L Na2HPO4，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4)進行梯度洗脫，收集樣品進行SDS-PAGE檢測。將目的蛋白透析除去高濃度咪唑后，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。

1.4 Nus-Endo Tb的水解活性檢測

初步反應以0.1 pmol的NGA2-Asn-Fmoc作為底物，加入150 ng蛋白酶液，100 mmol/L的醋酸緩沖液(pH 5.5)，37 ℃反應1 h。進行反應溫度優(yōu)化時，反應溫度分別為25～50 ℃，其他條件相同。進行pH優(yōu)化時，所用緩沖液為100 mmol/L pH值為3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，其他條件相同。在95 ℃加熱5 min終止反應，然后在10 μL的反應體系中加入40 μL去離子水，高效液相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率。檢測條件：Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱，流動相為0.3%的醋酸銨溶于57%的乙腈，流速1 mL/min，洗脫25 min，激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長315 nm，柱溫40 ℃，熒光檢測器檢測[10]。

1.5 Nus-Endo Tb底物特異性分析

以10 pmol不同的PA-糖鏈為底物，加入100～1 000 ng不等的蛋白酶液(調(diào)整使得每種底物轉(zhuǎn)化率在20%左右)，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中30 ℃反應1 h，95 ℃加熱5 min終止反應。在10 μL的反應體系中加入40 μL去離子水，高效液相色譜法分析其底物的轉(zhuǎn)化率。所用色譜柱為Supelcosil LC18柱(2.1 mm×150 mm)，流動相A為100 mmol/L醋酸-醋酸銨溶液，pH 4.0。流動相B為100 mmol/L醋酸-醋酸銨溶液，0.5%正丁醇，pH 4.0。5%～50%的流動相B線性洗脫25 min，流速為0.5 mL/min，在激發(fā)波長為320 nm、發(fā)射波長為400 nm的熒光條件下檢測，柱溫40 ℃[10]。

1.6 Nus-Endo Tb對糖蛋白的水解活性

分別以10 μg核糖核酸酶B和4 μg人類轉(zhuǎn)鐵蛋白作為糖蛋白底物，在20 μL反應體系中加入10 μg蛋白酶液，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中30 ℃反應過夜。反應樣品進行SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍染色后，脫色觀察酶切效率。

1.7 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性

在10 μL反應體系中，以100 μg唾液酸糖肽作為糖基供體，1.25 mmol/L MU-GlcNAc作為糖基受體，在100 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)中，加入10 μg Nus-Endo Tb酶液和5 mU來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶，在30 ℃分別反應15，30，45 min。各取5 μL反應液加入到96孔板中的250 μL甘氨酸緩沖液(150 mmol/L，pH 10.5)中混勻，在激發(fā)波長為355 nm，發(fā)射波長為460 nm的條件下讀取熒光值。將10 μg Nus-Endo Tb酶液在95 ℃加熱5 min使其滅活，同等條件下進行反應，作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Endo Tb的基因克隆及表達純化

通過數(shù)據(jù)庫檢索從布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的基因組中找到了ENGase的同源序列，通過用Clustal Omegae軟件進行序列比對，發(fā)現(xiàn)來源于布氏錐蟲的氨基酸序列和GH85家族的ENGase高度保守，如圖1-A(Endo-Tb的序列Tbr用黑色箭頭標出)。在圖1(左)中，高保守氨基酸用白色字體黑色方框表示，相似氨基酸用白色字體灰色方框表示。保守氨基酸E538和N536在Endo-M及其他ENGase中被證實分別是活性催化位點必需氨基酸和噁唑啉中間體形成的必需氨基酸[11-13](黑色星號標出)。在真核生物ENGases中高度保守的芳香族氨基酸已被報道是識別復合型糖鏈的必需氨基酸[14-15]，如圖1(右)，在Endo-Tb中相應位點的苯丙氨酸也是芳香族氨基酸(黑色圓點標出)，推測Endo-Tb有可能識別復合型糖鏈。

通過序列比對，確定Endo-Tb基因包含3個區(qū)域，分別為蛋白酶C97(6～146)區(qū)域[16]，PUB(230～300)區(qū)域[17]和GH85 (453～699)區(qū)域。GH85區(qū)域是ENGase酶的功能區(qū)域，為了探究前兩個區(qū)域的協(xié)助作用，本研究進行了截短型突變，其中FL為全長，D1截除了蛋白酶C97區(qū)域，D2截除了蛋白酶C97區(qū)域和PUB區(qū)域，如圖1-B所示。將3個長度不同的基因連接到帶有Nus融合蛋白的原核表達載體pET43a-10His-Nus上。將pET43a-10His-Nus-Endo-Tb (FL/D1/D2)分別在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導表達，然后通過HisTrpTMHP親和層析柱(GE)進行純化，產(chǎn)量約為5 mg/L。Nus是一個61 kDa的蛋白標簽，有助于增強融合蛋白的可溶性。Nus-Endo Tb (FL)融合蛋白大小為175 kDa，Nus-Endo Tb (D1)融合蛋白大小為159 kDa，Nus-Endo Tb (D2)融合蛋白大小為141 kDa。純化結(jié)果如圖1-C?？煽闯鯪us-Endo Tb (D1)的純度更高，無雜帶，但Nus-Endo Tb (FL)和Nus-Endo Tb (D2)蛋白有略微降解。

A-ENGases GH85家族氨基酸序列比對。Spn-肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)；Apr-原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)；Bha-耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodurans)；Cci-灰蓋鬼傘(Coprinopsis cinereal)；Omi-Ogataeaminuta；Mhi-凍土毛霉(Mucorhiemalis)；Tbr-布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)；Ath-擬南芥(Arabidopsis thaliana)；Cel-秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditise legans)；Hsa-現(xiàn)代人類(Homo sapiens)。B-Nus-Endo Tb (FL/D1/D2)蛋白的區(qū)域分布。Nus-pET43a表達載體上的融合蛋白標簽；Peptidase C97，蛋白酶C97區(qū)域；PUB-PUB區(qū)域；GH85-糖苷水解酶85家族區(qū)域。C-SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Nus-Endo Tb(FL/D1/D2)。M-Marker；1，Nus-Endo Tb(FL)；2-Nus-Endo Tb(D1)；3-Nus-Endo Tb(D2)圖1 Endo-Tb的基因構(gòu)造和蛋白純化Fig.1 Construction and purification of Endo-Tb

2.2 Nus-Endo Tb的水解活性檢測

2.2.1 對NGA2-Asn-Fmoc的水解活性

以NGA2-Asn-Fmoc為底物，分別添加150 ng純化酶液Nus-Endo Tb (FL/D1/D2)，反應后通過高效液相色譜法檢測到熒光產(chǎn)物GlcNAc-Asn-Fmoc(圖2)，說明3種蛋白酶液都可以水解NGA2-Asn-Fmoc中2個N-乙酰葡糖胺之間的β1-4糖苷鍵，驗證了在Endo Tb基因的3個區(qū)域中GH85區(qū)域是酶的功能區(qū)域。由于在蛋白純化之后獲得D1的純度明顯高于FL和D2，而且在純化之后對酶液存儲的過程中，D1的酶液相對于FL和D2更穩(wěn)定，不易出現(xiàn)降解和蛋白質(zhì)沉淀，說明PUB區(qū)域?qū)τ诰S持酶的穩(wěn)定性是有一定幫助的，所以本文最終選擇只用含有PUB區(qū)域和GH85區(qū)域的D1進行后續(xù)的研究。

圖2 HPLC檢測 Nus-Endo Tb的水解活性Fig.2 HPLC analysis of hydrolysis activity of Nus-Endo Tb

2.2.2 溫度和pH的優(yōu)化

為了確定酶的最適反應溫度，在溫度25～50 ℃范圍內(nèi)，測定D1對NGA2-Asn-Fmoc的水解活性，以最大酶活力為100%，計算相對酶活力，結(jié)果如圖3-A。當溫度在25～35 ℃時酶活較穩(wěn)定，溫度大于35 ℃時酶的活性迅速下降，最適溫度為30 ℃。然后在不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，測定pH值對酶活性的影響，以最大酶活力為100%，計算相對酶活力，結(jié)果如圖3-B。當pH低于4.0時酶失活，pH在6.0～7.0之間酶活較穩(wěn)定，當pH大于7.0酶活迅速下降，最適反應pH為6.5。

圖3 溫度和pH對酶活力的影響Fig.3 Optimization of temperature and pH

2.2.3 Nus-Endo Tb底物特異性分析

以各種結(jié)構(gòu)的PA-糖鏈作為底物，添加不同濃度的Nus-Endo Tb (D1)酶液，使得底物轉(zhuǎn)化率在20%左右，計算每種底物的比活力，然后以酶對三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的活力為100%，比較不同糖型相對于三甘露糖核心的相對活性。結(jié)果如表2中所示，Nus-Endo Tb (D1)對高甘露糖型的特異性更高，其中對7個甘露糖的糖鏈的活性最高，是三甘露糖核心的6倍以上，對6個甘露糖的糖鏈的活性是三甘露糖核心的4倍以上。但Nus-Endo Tb (D1)對短鏈的高甘露糖活性較低，對雙天線復合型糖鏈的活性約為三甘露糖核心的一半，而且不能作用于三天線復合型糖鏈。

表2 不同PA-糖鏈的相對酶活Table 2 Relative activities toward various PA-sugar

注：ND，無活性；●，甘露糖；■，N-乙酰氨基葡萄糖。

2.3 Nus-Endo Tb對糖蛋白的水解活性

天然牛胰核糖核酸酶B的N-糖鏈類型是高甘露糖型，糖鏈從5個甘露糖到9個甘露糖不等。人類轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖鏈是唾液酸化的雙天線型和三天線型的寡糖。以天然牛胰核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白為底物，檢測Nus-Endo Tb對糖蛋白的水解活性。以Endo-H和PNGase F作為對照，其中Endo-H可以切除高甘露糖中2個GlcNAc之間的連鍵，PNGase F可以水解N-糖蛋白中GlcNAc和天冬酰氨之間的連鍵，將糖蛋白上的糖鏈切除[18]。圖4結(jié)果顯示，Nus-Endo Tb可以完全切除核糖核酸酶B的高甘露型糖鏈，由于人類轉(zhuǎn)鐵蛋白含有三天線型寡糖，糖鏈不能被Nus-Endo Tb完全切除。

2.4 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性

A-M-Marker；1-未處理RNase B;2-Nus-Endo Tb酶切RNase B；3-Endo-H酶切RNase B B-M-Marker；1-未處理transferrin；2-Nus-Endo Tb酶切transferrin；3-PNGase F酶切transferrin圖4 核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白的水解Fig.4 Digestion of the N-glycan from RNase B and transferrin

來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶，作為一種糖苷內(nèi)切酶，可以水解GlcNAc2-MU中的熒光基質(zhì)底物四甲基傘形酮[19]，但是不能水解N-糖鏈中的核心殼二糖，也不能水解MU-GlcNAc中的四甲基傘形酮[20]。以SGP作為糖基供體，MU-GlcNAc作為糖基受體，首先SGP在Nus-Endo Tb的作用下發(fā)生水解，接著Nus-Endo Tb(D1)將水解后的糖鏈轉(zhuǎn)移到MU-GlcNAc受體上，殼聚糖酶可以水解掉GlcNAc2-MU中的熒光基質(zhì)底物MU，MU在堿性條件下變構(gòu)，在365 nm激發(fā)光照射下，發(fā)出460 nm發(fā)射光，根據(jù)熒光值的強度，可以檢測到Nus-Endo Tb轉(zhuǎn)糖基活性的大小。將這個Nus-Endo Tb(D1)和殼聚糖酶同時作用的復合酶反應體系，在30 ℃分別反應15，30，45 min，用pH 10.5甘氨酸緩沖液終止反應。通過MU的熒光值檢測到在反應的初始階段反應速度較快，30 min之后趨于平衡。以高溫滅活的Nus-Endo Tb作為陰性對照，相同條件下可以檢測到輕微熒光值，說明殼聚糖酶對熒光底物MU-GlcNAc具有輕微的水解作用，當Nus-Endo Tb存在時顯著增長的熒光值驗證了Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性。

圖5 Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性Fig.5 transglycosylation activity of Nus-Endo Tb

3 討論

在本研究中，發(fā)現(xiàn)了一種新的來源于布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)的ENGase，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的大量表達。在前期的工作中，曾嘗試通過His標簽純化Endo-Tb蛋白，但由于蛋白表達量很低，而且容易降解，難以純化。后來嘗試pET系統(tǒng)的不同載體及標簽，最后在pET43a載體上通過與N端的Nus標簽融合表達，大大提升了蛋白的表達量和穩(wěn)定性，成功純化出Nus-Endo Tb融合蛋白。后來嘗試切除Nus標簽，但切除后發(fā)現(xiàn)蛋白的穩(wěn)定性降低，所以選擇使用融合蛋白進行后續(xù)的實驗。

在Endo-Tb基因的全長序列中包含3個區(qū)域，即GH85區(qū)域之前還含有蛋白酶C97和PUB兩個區(qū)域。后來通過比較，發(fā)現(xiàn)PUB區(qū)域有利于維持蛋白的穩(wěn)定性，減少蛋白質(zhì)的降解。通過檢測水解活性以及底物特異性，Nus-Endo Tb能夠作用于高甘露糖型和復合型糖鏈，對含有7個甘露糖的糖鏈活性較高，其次是含有6個甘露糖的糖鏈，但是對三天線的雜合型糖鏈無活性。然后以天然牛胰核糖核酸酶B和人類轉(zhuǎn)鐵蛋白作為底物，檢測Nus-Endo Tb對糖蛋白的水解活性，Nus-Endo Tb對含有高甘露糖鏈的核糖核酸酶B的活性相對較高。當用唾液酸糖肽作為糖基供體，GlcNAc-MU作為糖基受體，通過來源于灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)的殼聚糖酶的作用，在這個復合酶體系中，檢測到Nus-Endo Tb的轉(zhuǎn)糖基活性。

由于Nus-Endo Tb水解活性很高，轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物很快就被自身再次水解，所以通過其他方法難以檢測到轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。在后續(xù)的研究中，還需要尋找一些能夠提高Nus-Endo Tb轉(zhuǎn)糖基活性的突變體，同時通過化學法合成合適的糖基噁唑啉作為糖基供體[21]，實現(xiàn)化學酶法合成新的糖肽和糖蛋白。