張敏佳，劉文穎，賈福懷，劉偉，周雅琳，熊菲菲，袁媛，蔡木易*，許雅君, 4

1(北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京，100191) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015) 3(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波，315012) 4(食品安全毒理學(xué)研究與評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100191)

生物活性肽是指對生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物，生物學(xué)意義主要體現(xiàn)在其優(yōu)于氨基酸的吸收機(jī)制和生理功能。已有研究顯示，不同種類的生物活性肽具有抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抗氧化和清除自由基等生物學(xué)作用[1]。目前，人們已從動(dòng)物、植物和微生物中制備了許多不同種類的生物活性肽[2]，其中植物蛋白來源主要是谷物，如大豆、小麥、大米、燕麥和黑麥等[3]。植物蛋白由于其來源廣泛，價(jià)格低廉，以其為原料利用適當(dāng)方法制備的低聚肽生物效價(jià)可接近動(dòng)物蛋白，因此對植物源生物活性肽的研究開發(fā)日益受到人們的重視[4]。

豌豆，別稱寒豆、麥豆、雪豆、畢豆、國豆等，種植廣泛，是我國重要的農(nóng)作物之一。豌豆的主要成分是淀粉和蛋白質(zhì)，豌豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，氨基酸比例均衡，基本達(dá)到FAO/WHO推薦模式值[5]。目前，我國對于豌豆蛋白尚未能進(jìn)行充分開發(fā)利用，相關(guān)研究較少，有限的研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白水解物具有抗氧化活性[6]，但對于豌豆肽的其他功能鮮有探索。本實(shí)驗(yàn)以CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠為模型，探究豌豆肽對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為豌豆肽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用豌豆肽干粉以豌豆蛋白為原料，經(jīng)酶解、精制、噴霧干燥、包裝后所得。

酪蛋白(Sigma C5890)，環(huán)磷酰胺(Sigma C0768)，北京寶瑞杰科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(奧豪斯SPN3001F)，電子天平(賽多利斯BS2000S)，NIKON TE2000-S 倒置熒光顯微鏡，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本光電工業(yè)株式會(huì)社，MEK-6318K)，流式細(xì)胞儀(美國BD FACS Calibur)，羅氏全自動(dòng)生化儀501，超微量分光光度計(jì)(德國Nano Photometer P-Class)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級雌性ICR小鼠，6～8周齡，體重(27±2) g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(京)2016—0010]。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝夜照明時(shí)間為12 h∶12 h。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，稱量初始體重，按體重隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為對照組，CTX模型組及豌豆肽低、中、高劑量組。實(shí)驗(yàn)第1～3天，除對照組外，其余各組每天腹腔注射80 mg/(kg·bw)CTX，建立免疫抑制小鼠模型，對照組每天注射等量生理鹽水。第4天起，每天給予對照組和CTX模型組1.6 g/(kg·bw)酪蛋白灌胃，豌豆肽低、中、高劑量組分別給予0.4、0.8、1.6 g/(kg·bw)豌豆肽，灌胃體積為0.1 ml/(10 g·bw)，連續(xù)灌胃15 d后動(dòng)物隔夜禁食，第二天晨起進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 體重和免疫臟器指數(shù)

分別于分組前及實(shí)驗(yàn)第15天稱量動(dòng)物初始體重和終末體重，并于動(dòng)物處死前再次稱量體重，用于免疫臟器指數(shù)計(jì)算。摘眼球取血后，斷頸處死小鼠，分離脾臟和胸腺，并用電子天平稱重，分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.5.2 免疫臟器形態(tài)學(xué)觀察

將稱重后的脾臟和胸腺固定于4%甲醛溶液中，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining ，HE 染色) ，顯微鏡下觀察脾臟組織和胸腺組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)

動(dòng)物摘眼球取血，取適量全血于EDTA抗凝管中，立即顛倒混勻，使用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)白細(xì)胞。

1.5.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA含量

每組取6只小鼠股骨進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)[7]：去除股骨附著的肌肉及結(jié)締組織，用1 mL Hank′s液將骨髓液沖洗至已加入EDTA的離心管內(nèi)。吸取0.38 mL 0.1 mol/L HCl溶液于另一離心管，加入混勻后的骨髓液20 μL混勻，靜置2～3 min待紅細(xì)胞溶解。取20 μL沖入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

另每組取6只小鼠股骨進(jìn)行骨髓DNA含量檢測[8]：吸取10 mL 5 mmol/L的CaCl2溶液，將全部骨髓沖入離心管中，在4 ℃條件下放置30 min，2 500 r/min離心15 min，棄掉上清，向沉淀物中加入0.2 mol /L的HClO4溶液5 mL，充分混勻，90 ℃水浴15 min，冷卻至室溫后，3 500 r/min離心15 min，取上清液，用超微量分光光度計(jì)在260 nm處測定吸光度A260值，計(jì)算骨髓DNA含量。

1.5.5 外周血免疫球蛋白含量測定

動(dòng)物摘眼球取血，離心制血清，取200 μL血清使用全自動(dòng)生化儀檢測免疫球蛋白IgG、IgM含量。

1.5.6 外周血、脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群檢測

收集小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸浮液，350×g離心5 min，棄上清，加入2 mL 1×裂解液將細(xì)胞沉淀重懸。冰上孵育5 min后加入2 mL PBS，350×g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS。計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106/100 μL。取100 μL細(xì)胞懸液于流式管，加入3種熒光染料綴合的抗體，避光孵育30 min，每5 min混勻1次。加入1 mL PBS清洗細(xì)胞，350×g離心5 min，棄上清，加300 μL 2%多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞亞群百分比。

1.5.7 血清中細(xì)胞因子水平測定

取50 μL血清，采用流式微球陣列(cytometric bead array，CBA)液相多重蛋白定量技術(shù)檢測細(xì)胞因子水平。使用Biolegend Multi-Analyte Flow Assay Kit并按其說明書制備標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 豌豆肽對免疫抑制小鼠體重和免疫臟器指數(shù)的影響

如表1所示，各組小鼠初始體重和終末體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，各組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。

表1 豌豆肽對免疫抑制小鼠體重和免疫臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of pea peptide on body weight and immune organ index of immunosuppression mice induced by CTX

2.2 豌豆肽對免疫抑制小鼠脾臟和胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響

顯微鏡下脾臟HE染色切片如圖1所示，對照組脾臟組織結(jié)構(gòu)清晰，白髓、紅髓、邊緣區(qū)界限明顯，脾小結(jié)發(fā)育良好。CTX模型組白髓與紅髓界限模糊，脾小結(jié)不完整。與模型組相比，豌豆肽低、中、高劑量組脾小結(jié)結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，脾臟結(jié)構(gòu)逐漸清晰。

A-對照組；B-模型組；C-低劑量組；D-中劑量組；E-高劑量組圖1 豌豆肽對免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)變化的影響(×100)Fig.1 Effects of pea peptide on morphologic variations of spleen of immunosuppression mice induced by CTX(×100)

胸腺HE染色切片如圖2所示，對照組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)染色較深且面積大于髓質(zhì)，淋巴細(xì)胞排列緊密。CTX模型組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)分界不清，皮質(zhì)面積減小，髓質(zhì)面積增大，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少。與模型組相比，豌豆肽低、中、高劑量組皮質(zhì)面積呈劑量依耐性增加，皮、髓交界清晰。

A-對照組；B-模型組；C-低劑量組；D-中劑量組；E-高劑量組圖2 豌豆肽對免疫抑制小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)變化的影響(×40)Fig.2 Effects of pea peptide on morphologic variations of thymus of immunosuppression mice induced by CTX(×40)

2.3 豌豆肽對免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

如表2所示，與對照組相比，CTX模型組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著下降(p<0.05)；豌豆肽干預(yù)后白細(xì)胞計(jì)數(shù)有不同程度的恢復(fù)，低劑量組與模型組相比有所增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，與對照組相比仍明顯偏低(p<0.05)，而豌豆肽中、高劑量組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比模型組顯著增高(p<0.05)，且恢復(fù)到了對照組的水平。

表2 豌豆肽對免疫抑制小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響Table 2 Effect of pea peptide on white blood cell count of immunosuppression mice induced by CTX

注：與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01；與模型組相比，#p<0.05，##p<0.01，下表同。

2.4 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA含量

如表3所示，與對照組相比，CTX模型組骨髓有核細(xì)胞濃度和骨髓DNA含量均顯著下降(p<0.01)。與模型組相比，豌豆肽低、中、高劑量組骨髓有核細(xì)胞濃度有不同程度的升高，低劑量組與模型組相比差異不顯著(p>0.05)，中、高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01，p<0.05)；豌豆肽低、中、高劑量組骨髓DNA含量與模型組相比均有顯著升高(p<0.05)。

表3 豌豆肽對免疫抑制小鼠骨髓有核細(xì)胞濃度和DNA含量的影響Table 3 Effect of pea peptide on nucleated cell counts and DNA density in bone marrow of immunosuppression mice induced by CTX

2.5 外周血免疫球蛋白含量測定

如表4所示，與對照組相比，CTX模型組外周血免疫球蛋白IgG、IgM含量顯著降低(p<0.01)。與模型組相比，豌豆肽高劑量組IgG、IgM含量顯著升高(p<0.01，p<0.05)。

表4 豌豆肽對免疫抑制小鼠外周血免疫球蛋白IgG、IgM含量的影響Table 4 Effect of pea peptide on concentration of immunoglobulin IgG and IgM of immunosuppression mice induced by CTX

2.6 脾臟T 淋巴細(xì)胞亞群檢測

如表5所示，與對照組相比，CTX模型組CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞百分比均顯著降低(p<0.01)。與模型組相比，豌豆肽低劑量組CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比有所改善，但差異不顯著(p>0.05)；豌豆肽中劑量組CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞百分比有不同程度的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01，p<0.05)，CD8+T淋巴細(xì)胞百分比有所改善，但差異不顯著(p>0.05)；豌豆肽高劑量組CD3+淋巴細(xì)胞百分比顯著增高(p<0.05)，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比有所改善，但差異不顯著(p>0.05)。

2.7 血清中細(xì)胞因子水平測定

如表6所示，與對照組相比，CTX模型組小鼠外周血中IFN-γ濃度顯著降低(p<0.05)。與模型組相比，豌豆肽中、高劑量組小鼠外周血中IFN-γ濃度顯著升高(p<0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。另外，豌豆肽低劑量組小鼠外周血中IL-9、IL-17A濃度與模型組相比顯著(p<0.05)，與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。其他各細(xì)胞因子(TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6)濃度在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 豌豆肽對免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響Table 5 Effect of pea peptide on T-lymphocyte subsets of spleen of immunosuppression mice induced by CTX

表6 豌豆肽對免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞因子水平的影響Table 6 Effect of pea peptide on T-lymphocyte subsets of spleen of immunosuppression mice induced by CTX

3 討論

植物蛋白占世界蛋白供應(yīng)總量的70%以上[4]， 因其營養(yǎng)豐富，價(jià)格低廉而日益受到人們的重視。我國幅員遼闊，植物資源豐富，許多重要的農(nóng)作物如大豆、小麥、玉米等均被開發(fā)出多種蛋白產(chǎn)品及其生物活性肽產(chǎn)品[3]。豌豆也是我國重要的農(nóng)作物之一，但目前對于豌豆蛋白尚未能進(jìn)行充分開發(fā)利用，其生物活性肽產(chǎn)品的功能學(xué)研究更少。實(shí)驗(yàn)中所用豌豆肽含有豐富氨基酸，其中谷氨酸和谷氨酰胺含量最高，已有研究[9-12]顯示谷氨酰胺具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能，因此，本實(shí)驗(yàn)采用目前制備動(dòng)物免疫抑制模型中應(yīng)用廣泛的CTX[13]，建立免疫抑制小鼠模型。同時(shí)，給予不同劑量豌豆肽干預(yù)15 d，探究豌豆肽的免疫調(diào)節(jié)功能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠初始體重和終末體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，提示環(huán)磷酰胺及環(huán)磷酰胺與豌豆肽對小鼠的生長發(fā)育無明顯影響。免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，可能是由于影響胸腺和脾臟指數(shù)的因素較多，準(zhǔn)確性難以保證，并且已有文獻(xiàn)指出免疫器官質(zhì)量不能單獨(dú)作為評價(jià)免疫毒性的指標(biāo)[14]，相似結(jié)果也在多項(xiàng)研究中出現(xiàn)[7, 15-16]。與空白對照組相比，模型組小鼠脾臟和胸腺鏡下形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)紊亂，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、免疫球蛋白IgG和IgM含量、骨髓有核細(xì)胞濃度和DNA含量均顯著低于對照組(p<0.01)，細(xì)胞因子IFN-γ濃度明顯低于對照組(p<0.05)，提示免疫抑制模型建立成功。

免疫器官是機(jī)體執(zhí)行免疫功能的重要部分，是免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化、成熟和增值的場所，脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，參與調(diào)解細(xì)胞和體液免疫，而胸腺是機(jī)體的主要中樞免疫器官，是T細(xì)胞生長、分化和成熟的場所，脾臟和胸腺在質(zhì)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)上的改變可在一定程度上反應(yīng)機(jī)體免疫功能的變化[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)與對照組相比無明顯變化，但CTX模型組小鼠脾臟、胸腺組織結(jié)構(gòu)被破壞，而豌豆肽組小鼠脾臟、胸腺結(jié)構(gòu)有所改善，且隨劑量升高而更接近對照組，提示豌豆肽對兩大免疫器官的組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

白細(xì)胞是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，骨髓是人體的造血組織，也是重要的免疫組織，白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低和骨髓的抑制狀態(tài)反映機(jī)體免疫功能下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTX模型組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)和DNA含量顯著降低，豌豆肽可增加免疫抑制小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)量以及骨髓DNA含量，可改善免疫抑制小鼠的免疫功能和骨髓抑制狀態(tài)。

免疫球蛋白是機(jī)體在抗感染方面的重要屏障，IgG、IgM是活化B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，可反映機(jī)體的體液免疫功能[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTX模型組小鼠外周血免疫球蛋白IgG和IgM含量顯著降低，豌豆肽可增加免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgG、IgM含量，表明豌豆肽對免疫抑制小鼠的體液免疫具有改善作用。

T淋巴細(xì)胞是一類在胸腺中成熟隨后遷移至外周淋巴組織的淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞免疫中起核心作用。細(xì)胞膜表面的CD3+為成熟T細(xì)胞表面標(biāo)志，反映總T淋巴細(xì)胞水平，根據(jù)CD4+和CD8+分子表達(dá)情況，可將成熟的T細(xì)胞分為CD4+或CD8+細(xì)胞，CD4+細(xì)胞即T輔助細(xì)胞(Th細(xì)胞)，CD8+細(xì)胞即細(xì)胞毒性T細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞亞群的平衡是反映機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTX模型組CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞百分比顯著降低，顯示免疫低下狀態(tài)。與模型組相比，豌豆肽中劑量組CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞百分比有不同程度的增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，豌豆肽高劑量組CD3+淋巴細(xì)胞百分比顯著增高，且各豌豆肽劑量組CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞百分比均比模型組升高，表明豌豆肽能調(diào)整免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的異常分布，對CTX致免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫具有一定的改善作用。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，在免疫應(yīng)答中占據(jù)著重要地位。CD4+T淋巴細(xì)胞存在許多亞群，包括Th1、Th2、Th17、Treg、Th9等[20]。Th1細(xì)胞主要通過分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要通過產(chǎn)生IL-4、IL-6等細(xì)胞因子輔助體液免疫應(yīng)答；Th17可通過分泌IL-17A、IL-17F等因子抵御胞外細(xì)菌和真菌感染；Th9作為一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，其分泌的主要細(xì)胞因子IL-9參與寄生蟲感染、自身免疫性疾病、腫瘤免疫等過程[20-22]。本研究顯示，豌豆肽將免疫抑制小鼠外周血細(xì)胞因子IFN-、IL-9、IL-17A水平改善至正常，提示豌豆肽可能通過調(diào)節(jié)IFN-γ、IL-9、IL-17A等細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而影響其介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，豌豆肽對于不同免疫的調(diào)節(jié)作用最佳有效劑量不同，對于大多數(shù)免疫指標(biāo)來說，在本研究劑量范圍內(nèi)，隨著干預(yù)劑量的增加，豌豆肽的免疫調(diào)節(jié)效果越顯著。綜上所述，豌豆肽能夠通過改善免疫器官發(fā)育、骨髓抑制狀態(tài)、免疫球蛋白含量、T淋巴細(xì)胞亞群百分比和細(xì)胞因子水平改善CTX致免疫抑制小鼠的免疫功能。本研究為豌豆肽的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。