王根杰，李德美，張亞東，辛聞，王宗義

(北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京，102206)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，簡稱EC)，是大多數(shù)發(fā)酵食品(如面包、牛奶等)和酒精飲料(啤酒、白酒、葡萄酒等)生產(chǎn)及貯存過程中產(chǎn)生的一種天然副產(chǎn)物[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，EC在生物體內(nèi)代謝時，被細胞色素P-450酶(cytochrome P-450，簡稱CYP)催化生成N-羥基-氨基-甲酸乙酯，后者誘導Cu2+調(diào)控的DNA損傷，引起DNA的氧化和脫嘌呤反應，使基因缺失或突變，這是EC致癌的主要原因[2-4]。2007年，國際癌癥研究機構(gòu)將EC的致癌級別由之前的2B類提升認定為2A類。一些主要葡萄酒生產(chǎn)國也相繼制定了本國的葡萄酒中EC含量的限定標準。美國葡萄餐酒中的EC限量為15 μg/L，加拿大、韓國和捷克生產(chǎn)葡萄酒中的EC限量為30 μg/L。目前，我國仍未制定葡萄酒中EC的限量標準。近年來，隨著我國居民消費水平的提高，葡萄酒的消費量也日益上升，EC作為一種潛在的致癌物質(zhì)已經(jīng)逐漸引起了社會關(guān)注并成為了熱門研究對象，因此EC限量標準的制定勢在必行。

葡萄酒在釀造過程中，尿素與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇結(jié)合是產(chǎn)生EC的主要途徑。尿素的來源主要是酵母代謝氨基酸(主要是精氨酸)和葡萄園施氮肥。氮是釀酒酵母保持發(fā)酵能力和生物活性的重要營養(yǎng)元素，氮源的過高或過低都會影響葡萄酒的發(fā)酵狀態(tài)[5]。當發(fā)酵葡萄汁中酵母可利用氮(yeast assimiable nitrogen, YAN)含量低于140 mg/L時，會導致酒精發(fā)酵遲緩或者停滯[6]；當葡萄汁中的YAN含量在200～480 mg/L時，葡萄酒的酒精發(fā)酵處于比較理想的狀態(tài)[7]。在生產(chǎn)過程中，添加酵母助劑可保證發(fā)酵的順利進行，然而酵母助劑的用量對葡萄酒釀造過程中EC產(chǎn)量的影響研究很少。

本研究的目的是比較不同發(fā)酵處理對EC產(chǎn)量的影響，從而找到控制酒精發(fā)酵過程中EC含量的釀造工藝，服務于葡萄酒生產(chǎn)。同時，為我國葡萄酒中EC限量標準的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)，2016年10月采收于河北懷來，成熟狀況、衛(wèi)生條件良好。酒精發(fā)酵酵母ST、BO213、F15和酵母助劑THIAZOTE均購自法國LAFFORT公司；銨離子氮試劑盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure(96 Assays per kit)、氨基酸氮試劑盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure(100 Assays per kit)，愛爾蘭Megazyme International Ireland有限公司；甲醇、冰醋酸(色譜級)，美國Mreda公司；乙腈(色譜級)，韓國SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯標準品、氨基甲酸乙酯內(nèi)標物(EC-d5)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙波長紫外分光光度計，北京Lab-Tech公司；Agilent 6410串聯(lián)液質(zhì)儀，美國Agilent公司；Heal Force?Super Series NW超純水系統(tǒng)，上海Canrex分析儀器有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗研究不同商業(yè)酵母在赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中EC產(chǎn)量的差異性，選用ST、BO213、F15三種對氮源具有不同敏感度的酵母進行試驗，酵母接種量均為0.2 g/L。根據(jù)常規(guī)工藝設(shè)計，在葡萄酒發(fā)酵過程中添加0.2 g/L酵母助劑THIAZOTE。

同時本試驗進行不同用量酵母助劑的研究，在接種了0.2 g/L酵母F15(酒莊發(fā)酵赤霞珠葡萄酒相同的酵母)的發(fā)酵罐中分別添加了0、0.3、0.6 g/L的THIAZOTE酵母助劑，分別記為YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6個處理均設(shè)置3次重復，共18個獨立發(fā)酵單元，分別在發(fā)酵初期(比重1.090)、發(fā)酵中期(比重1.040)和發(fā)酵末期(比重1.000)取樣測定。

赤霞珠葡萄汁分析結(jié)果顯示含糖量233 g/L、酸度(酒石酸計)7.90 g/L、pH 3.22、葡萄汁初始比重為1.096。

葡萄原料→分選→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精發(fā)酵→分離→穩(wěn)定與澄清處理→裝瓶

發(fā)酵前期溫度控制在20～22 ℃，每12 h進行1次壓帽操作；發(fā)酵中期溫度控制在25～28 ℃，每12 h進行2次壓帽操作；發(fā)酵后期溫度控制在22～25 ℃，不進行壓帽操作。

1.4 指標測定與方法

采收當天，根據(jù)標準[8]在相應葡萄地塊進行土樣的采集、處理和貯存，測定土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。葡萄采樣結(jié)束后，盡快送到實驗室進行壓榨與澄清處理，同時取葡萄汁樣品，貯存于-20 ℃低溫冰箱待測。

1.4.1 土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的測定[9]

土壤中銨態(tài)氮含量的測定：采用氯化鉀浸提-靛藍比色法，計算公式如下：

(1)

式中：C,顯色液銨態(tài)氮的質(zhì)量濃度，μg/kg；V,顯色液體積，mL；ts,分取倍數(shù)；m,土樣的質(zhì)量，g。

土壤中硝態(tài)氮含量的測定：采用紫外分光光度法，計算公式如下：

(2)

式中：C,通過回歸方程算出的NO3-N含量；25,測定液的總體積，mL；D,稀釋倍數(shù)；m,鮮土樣質(zhì)量，g。

1.4.2 葡萄汁中酵母可利用氮的測定[10]

采用試劑盒檢測氨基酸態(tài)氮和銨離子氮含量。計算公式如下：

(3)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(4)

式(3)中：X1,氨基酸態(tài)氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε,氮素在波長340 nm處的消光系數(shù)；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

(5)

ΔA=(A1-A2)樣-(A1-A2)空白

(6)

式(5)中：X2,銨離子氮含量，mg/L；V,終體積，mL；MW,氮摩爾質(zhì)量，g/mol；ε,氮素在波長340 nm處的消光系數(shù)；d,光路距離，cm；v,樣品體積，mL。

可同化氮含量/(mg·L-1)=X1+X2

(7)

1.4.3 葡萄酒理化指標的測定[11]

根據(jù)國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

1.4.4 葡萄發(fā)酵液或葡萄酒中EC含量的測定[12]

本試驗利用EC-d5作內(nèi)標進行測定，可以有效校正整個分析過程產(chǎn)生的誤差，使樣品處理更為簡易，降低了對人員熟練程度的要求[13]。

樣品前處理：將酒樣搖勻，立即準確取出1.00 mL于5 mL試管中，準確加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5內(nèi)標工作液，旋渦振蕩5 s，吸取樣液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.4.4.1 液相色譜-質(zhì)譜條件

XSELECT HSS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)，Zorbax Eclipse Plus-C18預柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)。柱溫為40 ℃，進樣體積為10 μL，流速為0.3 mL/min；流動相A為0.1%(V/V)乙酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫順序如表1所示。

電噴霧電離源正離子模式(ESI+)，多反應離子監(jiān)測方式監(jiān)測，MRM參數(shù)見表2。

干燥氮氣溫度為120 ℃，流速為10 L/min；霧化器壓力20 psi；噴霧毛細管電壓4 000 V。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 The sequence of gradient elution

表2 MRM參數(shù)表Table 2 The parameter of multiple reaction monitoring

注：*為定量離子。

1.4.4.2 校正標準曲線和回歸方程

按照內(nèi)標法測定EC含量得到的校正標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為y=7.919 7x+0.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，方程線性較好，適合本試驗中EC的含量測定。

圖1 內(nèi)標法測定EC的校正標準曲線Fig.1 The EC calibration standard curve

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理與分析，對葡萄酒中的理化指標進行多重比較分析。利用Excel繪制酒精發(fā)酵過程中的EC產(chǎn)量變化圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄園土壤中氮含量及葡萄中YAN測定

氮是釀酒葡萄樹體和果實生長的主要營養(yǎng)素。土壤中的氮素可分為有機氮和無機氮，本試驗采集葡萄園土樣做含氮量測定，其中銨態(tài)氮含量為38.68 mg/kg, 硝態(tài)氮含量為20.46 mg/kg。土壤中銨態(tài)氮含量要高于硝態(tài)氮含量，根據(jù)河北省葡萄果園地力評價標準，該試驗地土壤中的氮處于較低水平[8]。

銨態(tài)氮是酵母可同化氮素的主要成分[10]，是釀酒酵母優(yōu)先利用的無機氮源。土壤中的銨態(tài)氮水平會直接影響葡萄果實中的酵母可利用氮含量，經(jīng)測定葡萄原料中的酵母可利用氮含量為188.53 mg/L。符合葡萄酒發(fā)酵所需最低140～150 mg N/L的要求[6]。

2.2 實驗葡萄酒理化指標檢測

酒精發(fā)酵結(jié)束后，葡萄酒經(jīng)自然澄清后，與酒泥分離，經(jīng)過穩(wěn)定處理后裝瓶，2個月后取樣檢測葡萄酒的理化指標，結(jié)果如表3。

由表3可以看出，不同酵母和不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中理化指標含量均無明顯差異。葡萄酒主要理化指標正常，滿足酒精度≥7.0%，還原糖≤4 g/L和揮發(fā)酸≤1.2 g/L的要求[9]。葡萄酒發(fā)酵過程控制合理，符合干紅葡萄酒的發(fā)酵要求，保證了葡萄酒中EC含量的正常測定。

表3 赤霞珠葡萄酒理化指標Table 3 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon wine with different treatment

注：同列不同小寫字母表示p<0.05水平差異顯著。

2.3 不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的差異分析

精氨酸是葡萄汁中含量最豐富的氨基酸之一。在酒精發(fā)酵過程中，當發(fā)酵液中精氨酸含量過高時，會在酵母菌內(nèi)代謝產(chǎn)生過量的尿素。酵母細胞內(nèi)的尿素不會立即降解，使胞內(nèi)的尿素含量積累過多，酵母菌的氮代謝受到抑制。酵母菌將過多的尿素由胞內(nèi)釋放到發(fā)酵液中，尿素和發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇結(jié)合生成EC。

發(fā)酵過程中不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒EC產(chǎn)量的差異性結(jié)果如圖2，結(jié)果顯示酵母ST、BO213和F15釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量存在差異。隨著發(fā)酵的進行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越來越少，酵母菌開始代謝精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代謝產(chǎn)生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒體中，與已積累的乙醇反應生成EC[14]。在發(fā)酵初、中期階段，3種酵母釀造葡萄酒均有少量的EC產(chǎn)生，而在不同酵母釀造的葡萄酒之間EC的產(chǎn)量具有差異。發(fā)酵末期，酵母BO213與ST、F15相比，釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增長了45.0%和16.0%。這可能與不同酵母需氮量、氮代謝及尿素分泌能力有關(guān)。

a-發(fā)酵初期(1.090)；b-發(fā)酵中期(1.040)，此時添加酵母助劑；c-發(fā)酵末期(1.000)圖2 不同酵母處理不同發(fā)酵階段的EC產(chǎn)量Fig.2 Comparison of three different yeasts fermented on EC production during fermentation

2.4 不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的差異

在酒精發(fā)酵過程中，酵母進行生長繁殖和代謝，會逐漸消耗葡萄汁中的氮源物質(zhì)。當發(fā)酵液中氮源物質(zhì)缺乏時，會延緩發(fā)酵甚至停滯。酵母助劑的成分主要是(NH4)2HPO4，可以補充酵母所需氮源，加快發(fā)酵速率。而過量的(NH4)2HPO4會使酵母代謝過剩，從而產(chǎn)生EC。

本試驗酒精發(fā)酵過程中，不同用量酵母助劑處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量差異性如圖3。在發(fā)酵中期添加酵母助劑后，不同用量酵母助劑處理釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量與發(fā)酵前期相比均有增長，且YN0.3、YN0.6均比對照組YNCK釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量高。與發(fā)酵中期相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在發(fā)酵末期的EC產(chǎn)量分別增長了37.5%、38.0%、33.3%，表明酵母助劑的使用有提高EC產(chǎn)量的風險。而在發(fā)酵末期，不同用量酵母助劑釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量差異顯著，與YNCK相比，YN0.3和YN0.6釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量分別增加了25.5%和45.5%，結(jié)果顯示，酵母助劑用量增加所釀造的葡萄酒中EC產(chǎn)量越大。

a-發(fā)酵初期(1.090)；b-發(fā)酵中期(1.040)，此時添加酵母助劑；c-發(fā)酵末期(1.000)圖3 酵母助劑不同用量處理不同發(fā)酵階段EC產(chǎn)量Fig.3 Comparison of three different yeast nutrients used on EC production during fermentation

2.5 不同處理獲得的赤霞珠葡萄酒中EC含量結(jié)果分析

葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過澄清、過濾、裝瓶，置于瓶儲室(溫度在15～20 ℃，空氣相對濕度在65%～70%)儲存。裝瓶2個月后取樣，測定各處理獲得的赤霞珠葡萄酒中的EC含量如表4。

表4 赤霞珠葡萄酒中的EC含量 單位：μg/LTable 4 EC content in Cabernet Sauvignon wine

由表4可以看出，不同處理釀造的赤霞珠葡萄酒中EC含量均較低，都遠低于美國或歐盟限定標準[15]。

3 結(jié)論與討論

本試驗主要研究不同發(fā)酵處理對赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的影響，選擇不同酵母和不同用量酵母助劑發(fā)酵進行研究。試驗結(jié)果表明，在葡萄酒發(fā)酵過程中，不同酵母釀造的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量差異顯著，就選擇的3種酵母而言，酵母BO213的EC產(chǎn)量多于酵母F15和ST。在選擇酵母F15的前提下，發(fā)酵過程中使用酵母助劑用量多的赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量較高，產(chǎn)量高低順序為YN0.6>YN0.3>YNCK。發(fā)酵過程中，赤霞珠葡萄酒中EC產(chǎn)量的變化趨勢為，發(fā)酵初期階段和發(fā)酵中期階段產(chǎn)生較少，發(fā)酵后期階段EC產(chǎn)量較多。

在整個實驗過程中，測定的赤霞珠葡萄酒中的EC含量范圍為1.9～8.0 μg/L，均未超過美國或歐盟限量水平[15]。在實驗葡萄園現(xiàn)有的土壤氮素營養(yǎng)水平下，使用酵母ST(接種量為0.2 g/L)或使用酵母F15(接種量為0.2 g/L)且不添加酵母助劑，可以使赤霞珠葡萄酒發(fā)酵順利進行，釀造的葡萄酒中EC的產(chǎn)量符合美國或歐盟的限量標準，同時可以使葡萄酒中的EC產(chǎn)量保持在較低水平。