王程成，陳雙，王棟，徐巖

(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫,214122)

黃酒是我國民族特色酒精飲料，其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，深受我國和世界消費(fèi)者的喜愛。“焦糖香”是我國黃酒具有的重要感官特征，是描述黃酒香氣特征的7個(gè)主要描述詞之一[1]。前期有研究采用氣相色譜-嗅聞技術(shù)(gas chromatography-olfactometry，GC-O)首次研究發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯是構(gòu)成甜型黃酒“焦糖香”特征香氣的關(guān)鍵香氣化合物[2]，但對于我國黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的含量分布情況及其對風(fēng)味的貢獻(xiàn)還缺乏系統(tǒng)的研究。

葫蘆巴內(nèi)酯(sotolon)，又名3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)呋喃酮，是一種香氣強(qiáng)烈的手性內(nèi)酯化合物，在空氣中的閾值僅為0.02 ng/L[3]。葫蘆巴內(nèi)酯在食品中香氣表現(xiàn)復(fù)雜，低質(zhì)量濃度時(shí)呈現(xiàn)焦糖、醬油的香氣特征，而在較高質(zhì)量濃度時(shí)則呈現(xiàn)咖喱的香氣特征[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯是構(gòu)成眾多食品(如葡萄酒、陳年日本清酒、咖啡、醬油、糖漿等)香氣特征的關(guān)鍵香氣化合物[5-7]。由于葫蘆巴內(nèi)酯獨(dú)特的感官特征，其在釀造酒中的風(fēng)味功能尤其受到關(guān)注。早在1976年DUBOIS等人首次在法國金黃葡萄酒(Vin Jaune)中發(fā)現(xiàn)了葫蘆巴內(nèi)酯的存在[8]，同年TAKAHASHI等人研究發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯是構(gòu)成陳年清酒“焦糖香”特征的關(guān)鍵香氣物質(zhì)[9]。隨后近半個(gè)世紀(jì)的研究逐步明確葫蘆巴內(nèi)酯是構(gòu)成多種類型葡萄酒香氣特征的關(guān)鍵香氣化合物，如貴腐葡萄酒(Botrytised wine)[10]、雪利酒(Sherry wine)[11-12]、馬德拉酒(Madeira wine)[13]、波特酒(Port wine)[14-15]等。由于葫蘆巴內(nèi)酯在酒中的重要風(fēng)味作用，對該物質(zhì)的分析監(jiān)控成為很多發(fā)酵酒品質(zhì)控制的重要手段。

由于葫蘆巴內(nèi)酯具有極性大、穩(wěn)定性差，且在飲料酒中含量低，對該物質(zhì)的準(zhǔn)確分析檢測具有較大的挑戰(zhàn)。常用的固相微萃取技術(shù)、攪拌棒吸附萃取技術(shù)等樣品前處理方法難以對該物質(zhì)進(jìn)行有效的富集。早期對該物質(zhì)的檢測一般采用大樣品量液液萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)進(jìn)行分析[13, 15-16]，但該方法存在有機(jī)溶劑用量大、操作繁瑣、勞動(dòng)強(qiáng)度大的缺點(diǎn)。陳雙等人[2]開發(fā)了基于固相萃取技術(shù)(solid-phase extraction，SPE)及微管大體積進(jìn)樣技術(shù)(microvial insert large volume injection，LVI)聯(lián)合GC-MS測定黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量的方法，但該方法需要用到專用的設(shè)備，難以推廣應(yīng)用。為了研究葫蘆巴內(nèi)酯在黃酒中的風(fēng)味貢獻(xiàn)并對風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控，急需開發(fā)一種簡單、快速測定黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量的方法。

因此，本研究基于液液微萃取(liquid-liquid microextraction，LLME)結(jié)合GC-MS技術(shù)建立了黃酒中“焦糖香”特征香氣物質(zhì)葫蘆巴內(nèi)酯的快速檢測方法，并進(jìn)一步研究了該物質(zhì)在黃酒中的分布情況及風(fēng)味貢獻(xiàn)。研究結(jié)果將有助于增進(jìn)對黃酒風(fēng)味化學(xué)理論的認(rèn)識和風(fēng)味品質(zhì)的控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葫蘆巴內(nèi)酯(純度 ≥97.0%，GC)，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(內(nèi)標(biāo)，98%，GC)，戊烷(色譜純)和正構(gòu)烷烴(C5-C30)購買于Sigma-Aldrich(中國上海)公司。Na2SO4、NaCl及乙醚(分析純)購買于中國國藥上海化學(xué)試劑公司。乙醇(色譜純)購買于百靈威科技有限公司。二氯甲烷(色譜純)和巴斯德吸管購買于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

市售黃酒樣品(24個(gè)樣本，來自4個(gè)不同地區(qū))。其中浙江地區(qū)共10種黃酒分別命名為Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9、Z-10，江蘇地區(qū)包括7種黃酒分別命名為J-1、J-2、J-3、J-4、J-5、J-6、J-7，上海地區(qū)包括3種黃酒分別命名為S-1、S-2、S-3，其他地區(qū)包括4種黃酒分別命名為：Q-1、Q-2、Q-3、Q-4。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：氣相色譜(GC 6890N)-質(zhì)譜(MS 5975)，安捷倫公司(美國)；多功能自動(dòng)進(jìn)樣器，德國Gerstel公司；漩渦振蕩儀(GENIUS 3)，IKA；氮吹儀(organomation N-EVAP)，上海安譜；電子天平，Mettler-Toledo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

取20 mL黃酒于60 mL的樣品瓶中，加入內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(100 mg/L，40 μL)及20 mL飽和NaCl溶液混勻，再加入5 mL CH2Cl2作為萃取劑。將混合樣品瓶放置于渦旋振蕩儀上以500 r/min振蕩萃取5 min，靜置30 min分層后，使用巴斯德吸管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至10 mL的樣品瓶中，加入無水Na2SO4過夜后，氮吹濃縮至1 mL，貯存在-20 ℃條件下，等待進(jìn)樣。

1.3.2 GC-MS條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：氣相色譜(GC 6890N)-質(zhì)譜(MS 5975)；色譜柱：DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷倫公司)。GC條件：氦載氣，流速1 mL/min，初始柱箱溫度50 ℃，維持2 min，6 ℃/min上升至230 ℃，維持15 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流模式，進(jìn)樣量1 μL。MS條件：溶劑延遲時(shí)間為8 min ，EI電離源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描范圍35～350 amu。分析過程采用選擇離子監(jiān)測(SIM)模式，選擇離子為83、128、121、178。其中83、128和121、178分別作為葫蘆巴內(nèi)酯和內(nèi)標(biāo)的定性定量離子。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用色譜純乙醇及超純水配制模擬黃酒基質(zhì)溶液(含5.0 g/L乳酸，pH=4.5，酒精度為15% vol)備用。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品溶解于色譜級乙醇中配置成葫蘆巴內(nèi)酯母液(10 000 mg/L)。吸取一定體積葫蘆巴內(nèi)酯母液在模擬黃酒溶液中配置成一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行GC-MS分析，采用安捷倫工作站進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

1.3.4 黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯定性定量

定性：葫蘆巴內(nèi)酯的定性首先與NIST 08(Agilent Technologies Inc.)質(zhì)譜庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖對比匹配、文獻(xiàn)中葫蘆巴內(nèi)酯的保留指數(shù)比對進(jìn)行初步鑒定，然后與葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖及保留指數(shù)比對并進(jìn)行進(jìn)一步定性。

定量：采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對葫蘆巴內(nèi)酯進(jìn)行定量，將目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值、峰面積比值分別作為橫縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將樣品中的目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行黃酒樣品中葫蘆巴內(nèi)酯質(zhì)量濃度的計(jì)算。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

回收率：通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品分析可以明確葫蘆巴內(nèi)酯在黃酒中的含量，在黃酒樣品中加入葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)計(jì)算公式進(jìn)行回收率R的驗(yàn)證:

式中:C0為加標(biāo)前樣品中的葫蘆巴內(nèi)酯質(zhì)量濃度；C1為添加進(jìn)樣品中的葫蘆巴內(nèi)酯質(zhì)量濃度；C2為加標(biāo)后黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯質(zhì)量濃度。

精密度：對同一樣品進(jìn)行GC-MS分析，根據(jù)測得的含量進(jìn)行精密度驗(yàn)證。當(dāng)日精密度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為同一天早中晚分別測定同一組樣品3次，以其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)表示；隔日精密度為連續(xù)3 d進(jìn)樣同一組樣品，同樣以RSD表示。以上過程重復(fù)3次。

1.3.6 黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯閾值測定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的閾值測定的方法[17-18]，在模擬黃酒酒樣(15%vol乙醇-水溶液，含5.0 g/L乳酸，pH=4.0)中添加葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步測定嗅覺感知的質(zhì)量濃度范圍，預(yù)計(jì)能聞到的大概質(zhì)量濃度范圍后，在這個(gè)質(zhì)量濃度范圍左右配制7種不同質(zhì)量濃度葫蘆巴內(nèi)酯溶液。24位經(jīng)過訓(xùn)練的品評員(22～26歲)參加閾值測定，從低質(zhì)量濃度開始，逐一用三杯法，其中2杯是黃酒模擬酒樣，另1杯是添加葫蘆巴內(nèi)酯的模擬黃酒(杯子以隨機(jī)3位數(shù)進(jìn)行編碼)，品評員需在進(jìn)行測試過程中記錄下自己感知到的3杯黃酒中明顯不同的一杯的序號。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取方法及萃取劑的選擇

由于葫蘆巴內(nèi)酯極性較強(qiáng)且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，萃取溶劑的選擇對分析效果有決定性的影響。本研究比較了二氯甲烷、乙醚、戊烷對黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯萃取效果的影響。采用20 mL酒樣，分別加入5 mL的不同萃取劑，萃取后分離出萃取劑濃縮至1 mL后進(jìn)行GC-MS分析，得到的譜圖如圖1所示，從該化合物的響應(yīng)可看出3種溶劑萃取效果：二氯甲烷>乙醚>戊烷。通過對3種溶劑萃取的樣本進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率的測試發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷萃取后的樣品回收率較高(>89%)。綜合萃取效果及回收率等因素，最終選取二氯甲烷作為黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的萃取劑。

圖1 不同溶劑對黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯萃取效果的影響Fig.1 The effects of different solvents on the extraction of sotolon in Chinese rice wine

2.2 定量離子的選擇

通過在樣品中加入內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮萃取后進(jìn)行全掃描(Scan)發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯的峰型不佳，且干擾離子較多，對準(zhǔn)確定量影響較大。根據(jù)葫蘆巴內(nèi)酯和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯的特征離子中83和128相對其他特征離子來說干擾較小，因此選擇其作為葫蘆巴內(nèi)酯的定量離子，而內(nèi)標(biāo)則選擇121與178作為其定量離子，采用選擇離子監(jiān)測模式(SIM)進(jìn)行定量分析。圖3為SIM模式下的樣品分析色譜圖，圖中截取了葫蘆巴內(nèi)酯及內(nèi)標(biāo)的色譜圖，葫蘆巴內(nèi)酯與4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的出峰時(shí)間分別在30.223 min和31.647 min左右。SIM模式相對全掃描模式來說針對性更強(qiáng)，更具選擇性，峰型更好，能夠較好的實(shí)現(xiàn)極微量目標(biāo)物的檢測。

圖2 Scan模式下葫蘆巴內(nèi)酯及內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrum of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl)-2-butanone in full scan mode

圖3 SIM模式下葫蘆巴內(nèi)酯及內(nèi)標(biāo)4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的色譜圖Fig.3 The chromatogram of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl) -2-butanone in SIM mode

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法學(xué)參數(shù)的驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

在模擬黃酒中配制一系列質(zhì)量濃度梯度的葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。通過安捷倫工作站分析獲得黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體方法學(xué)參數(shù)見表1。結(jié)果顯示葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，R2=0.994。以信噪比(S/N)為3的質(zhì)量濃度0.66 μg/L作為方法的檢出限，以信噪比(S/N)為10的質(zhì)量濃度1.02 μg/L作為方法的定量限，其定量限及檢測限都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該化合物在黃酒中的含量，也低于前期基于SPE-LVI-GC-MS方法的定量限。

表1 基于液液微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的方法學(xué)參數(shù)Table 1 Quantitative determination of sotolon in Chinese rice wine based on liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry

2.3.2 回收率及精密度

將葫蘆巴內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品加到4個(gè)實(shí)際樣品中，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，計(jì)算其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)，結(jié)果顯示所有樣品中測定的回收率均在80%～120%之間，且RSD在10%以內(nèi)。當(dāng)日精密度及隔日精密度的RSD均在10%以內(nèi)，說明該方法滿足黃酒中微量物質(zhì)的定量要求。

表2 不同樣品中葫蘆巴內(nèi)酯加標(biāo)回收率及精密度(n=3)Table 2 The recovery rate and precision of sotolon in different rice wine samples (n=3)

2.4 不同地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的分布規(guī)律

采用本研究建立的LLME-GC-MS方法對我國不同地區(qū)的24個(gè)黃酒樣品中葫蘆巴內(nèi)酯含量進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示在所有分析的黃酒樣品中均能檢測到葫蘆巴內(nèi)酯的存在，說明該化合物在黃酒中普遍存在。表3列出了不同地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量分布情況，結(jié)果顯示本研究分析的市售黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量在42.05～244.34 μg/L之間，且不同地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量差異明顯。浙江與上海地區(qū)的黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量均在100 μg/L以上，最高含量達(dá)到244.34 μg/L(Z-6)。但是其他地區(qū)(含量在52.49～79.18 μg/L)及江蘇地區(qū)(含量在42.05～81.05 μg/L)的黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量則是明顯低于浙江和上海地區(qū)的黃酒。從圖4的箱型圖可直觀看出各地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量分布情況，圖中結(jié)果顯示浙江及上海地區(qū)的黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量明顯高于其余兩個(gè)地區(qū)的黃酒。此外，通過單因素方差分析對4個(gè)地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量進(jìn)行了差異性比較，結(jié)果顯示浙江地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯與江蘇及其他地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量均存在顯著性差異(p<0.001)，而上海地區(qū)黃酒與江蘇及其他地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量也存在顯著性差異(p<0.05)，這說明葫蘆巴內(nèi)酯可能是區(qū)分不同區(qū)域黃酒風(fēng)味差異的關(guān)鍵香氣物質(zhì)之一。

表3 不同地區(qū)黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量及OAVTable 3 The concentration and OAV of sotolon in Chinese rice wine in different regions

注：平均質(zhì)量濃度為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均質(zhì)量濃度；SD為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

為了進(jìn)一步研究葫蘆巴內(nèi)酯對黃酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)，采用文獻(xiàn)中報(bào)道的方法首次測定了黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的香氣閾值，黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯在黃酒基質(zhì)中的香氣閾值為11 μg/L，是黃酒中典型的“量微香大”的香氣化合物。

香氣活力值(odor activity value，OAV)表示香氣化合物質(zhì)量濃度與閾值的比值，是目前研究香氣化合物香氣貢獻(xiàn)的有效方法。當(dāng)化合物在酒中含量超過其閾值，即OAV≥1，說明該物質(zhì)對酒的整體香氣是有貢獻(xiàn)的[19]。通過測定的黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯的香氣閾值及市售酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量進(jìn)行OAV的計(jì)算，從表3可明顯看出葫蘆巴內(nèi)酯在所有黃酒中的OAV均大于4，其中，江蘇地區(qū)及其他地區(qū)黃酒中OAV在4～7之間，浙江及上海地區(qū)的黃酒中OAV大于等于10，說明該化合物對黃酒香氣具有重要貢獻(xiàn)。從圖4的箱型圖同樣可直觀地看出所有黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯質(zhì)量濃度均在閾值(11 μg/L)之上，其對黃酒的整體香氣有極大的貢獻(xiàn)。

圖4 不同區(qū)域黃酒中葫蘆巴內(nèi)酯含量分布Fig.4 The concentration of sotolon in Chinese rice wine from different Regions

3 結(jié)論

本研究基于液液微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)建立了黃酒中“焦糖香”特征香氣物質(zhì)葫蘆巴內(nèi)酯含量的檢測方法。該方法檢測限低至1.02 μg/L，測定準(zhǔn)確性和精密度良好。該方法具有樣品用量少，簡單快速的特點(diǎn)，能夠滿足黃酒中關(guān)鍵香氣葫蘆巴內(nèi)酯批量快速檢測的需要。采用該方法分析了不同地域24款典型黃酒樣品中葫蘆巴內(nèi)酯的含量，結(jié)果顯示該物質(zhì)在黃酒中普遍存在，且含量在42.05～244.34 μg/L之間。首次測定了黃酒基質(zhì)中葫蘆巴內(nèi)酯的香氣閾值(11 μg/L)，并基于OAV研究了葫蘆巴內(nèi)酯在黃酒中的風(fēng)味作用，結(jié)果顯示所有測定樣品中葫蘆巴內(nèi)酯含量均高于其香氣閾值，表明該物質(zhì)對黃酒整體香氣具有重要影響。進(jìn)一步比較分析發(fā)現(xiàn)葫蘆巴內(nèi)酯在浙江和上海地區(qū)黃酒中含量顯著高于其余地區(qū)黃酒，表明葫蘆巴內(nèi)酯可能是一個(gè)能區(qū)分不同區(qū)域黃酒的潛在標(biāo)志性化合物。