李欣春 梁昊 胡志希 胡思遠(yuǎn) 鐘森杰 李琳 李杰 簡(jiǎn)維雄 郭志華

〔摘要〕 目的 研究參附注射液和參麥注射液對(duì)高血壓心力衰竭大鼠的療效差異，通過(guò)“以方測(cè)證”理論推測(cè)高血壓心衰大鼠所屬中醫(yī)證型。方法 將60只Dahl鹽敏感性大鼠分為對(duì)照組、模型組、參附組和參麥組，每組15只，對(duì)照組使用低鹽飼料，其余三組使用8%NaCl高鹽飼料喂養(yǎng)大鼠20周并予以相應(yīng)干預(yù)，檢測(cè)大鼠血清氨基末端腦鈉肽前體（n-terminal pro-brain natriuretic peptide， NT-proBNP），彩色超聲多普勒檢測(cè)大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction， LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening， LVFS）及觀察HE染色心肌細(xì)胞。結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組LVEF和LVFS值均降低（P<0.05），NT-proBNP值升高（P<0.01）；與模型組比較，參附組LVEF和LVFS值明顯降低（P<0.05），NT-proBNP值升高（P<0.01）；參麥組LVFS值升高（P<0.05），NT-proBNP值降低（P<0.01）；與參附組比較，參麥組LVEF和LVFS值均升高（P<0.05）。結(jié)論 參麥注射液對(duì)高血壓心衰大鼠的療效顯著，參附注射液對(duì)高血壓心衰大鼠無(wú)效；高血壓心衰大鼠模型不屬于心陽(yáng)虛證，最可能是心氣陰虛證；LVEF值保留及血壓升高可能是應(yīng)用參附注射液的禁忌指標(biāo)。

〔關(guān)鍵詞〕 高血壓；心力衰竭，方證對(duì)應(yīng)；大鼠動(dòng)物模型；中醫(yī)證型

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R541.3 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.003

〔Abstract〕 Objective To investigate the traditional Chinese medicine （TCM） syndrome types in rats with hypertensive heart failure based on the theory of "Syndrome Differentiation Through Formula" by investigating the clinical efficacy of Shenfu injection versus Shenmai injection in rats with hypertensive heart failure. Methods A total of 60 Dahl salt sensitive rats were equally and randomly divided into control group， model group， Shenfu injection group （Shenfu group）， and Shenmai injection group （Shenmai group）. The control group was fed with low-salt feed， while the other three groups were fed with high-salt （8% NaCl） feed for 20 weeks and given respective interventions. The serum level of N-terminal-pro-brain natriuretic peptide （NT-proBNP） was measured. The left ventricular ejection fraction （LVEF） and the left ventricular fractional shortening （LVFS） were determined by color Doppler ultrasound. And the myocardial cells with HE staining was observed under an electron microscope. Results Compared with the control group， the model group had significantly decreased LVEF and LVFS （P<0.05） and a significantly increased serum level of NT-proBNP （P<0.01）. Compared with the model group， the Shenfu group had significantly decreased LVEF and LVFS （P<0.05） and a significantly increased serum level of NT-proBNP （P<0.01）； the Shenmai group had a significantly increased LVFS （P<0.05） and a significantly decreased serum level of NT-proBNP （P<0.01）. Compared with the Shenfu group， the Shenmai group had significantly increased LVEF and LVFS （P<0.05）. Conclusion In rats with hypertensive heart failure， Shenmai injection has significant clinical efficacy， while Shenfu injection has no effect. The rat model of hypertensive heart failure is not identified as heart-Yang deficiency syndrome and is most likely to be heart-Qi and Yin deficiency syndrome. The preserved LVEF and increased blood pressure may be the contraindications for Shenfu injection.

〔Keywords〕 hypertension； heart failure； syndrome differentiation through formula； rat model； traditional Chinese medicine syndrome type

心力衰竭（心衰）是多種心臟病的終末期階段，發(fā)病率高[1-2]，隨年齡增加呈明顯上升趨勢(shì)，5年存活率與惡性腫瘤相仿，是嚴(yán)重威脅老年人健康的危重病、多發(fā)病[3]。盡管醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，但心衰的病死率和住院率依然居高不下[4]。

臨床研究表明[5]參附注射液治療舒張性心力衰竭療效顯著，并提出治療機(jī)制可能與改善心肌重構(gòu)、抑制神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)度激活有關(guān)；然而又有臨床研究提出[6]，參麥注射液治療氣陰兩虛型舒張性心力衰竭有確切的療效；且多項(xiàng)研究表明二者在心力衰竭治療上均表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，比單純西藥治療效果更佳[7-8]。

但是，參附注射液在臨床上常用于治療陽(yáng)虛證、陰竭陽(yáng)脫證患者；參麥注射液臨床上廣泛用于氣陰兩虛型患者；參附注射液和參麥注射液適應(yīng)中醫(yī)證型不同。因此，我們推測(cè)由不同病理機(jī)制導(dǎo)致的心衰大鼠模型存在中醫(yī)證型上的差異。為此，我們以高血壓心衰大鼠為研究對(duì)象，對(duì)比兩種注射液的療效差異，推測(cè)其中醫(yī)證候與病理本質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Dahl鹽敏感性大鼠60只，體質(zhì)量（220±10） g，由北京維通利華動(dòng)物公司提供，動(dòng)物合格證編號(hào)為：11400700134072，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.2 儀器與主要試劑

超低溫冰箱Forma 900series，美國(guó)Thermo公司；5417R型小型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，深圳開(kāi)立科技有限公司；智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-2010A，北京Softron公司；大鼠NT-proBNP ELISA試劑盒96T，CUSABIO公司，產(chǎn)品批號(hào)：CSB-E08752r；參麥注射液20 mL/瓶，正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1402225；參附注射液10 mL/瓶，雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)：140205010。

1.3 造模方法

將60只Dahl鹽敏感性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、參附注射液組（簡(jiǎn)稱參附組）、參麥注射液組（簡(jiǎn)稱參麥組）和模型組。每組15只，每3只老鼠一籠。對(duì)照組大鼠喂養(yǎng)0.3%NaCl低鹽飼料，其余3組大鼠喂養(yǎng)8%NaCl高鹽飼料，每籠每天喂養(yǎng)飼料60 g，自由取水，每2天換洗籠子1次。

1.4 模型評(píng)價(jià)

與對(duì)照組比較，參附注射液組、參麥注射液組和模型組3組大鼠血壓和血清NT-ProBNP含量顯著升高（P<0.01），LVEF、LVFS顯著下降（P<0.01），心肌HE染色病理檢查結(jié)果也有顯著變化，成功建立高血壓心力衰竭模型[9]。

1.5 干預(yù)方法

均通過(guò)腹腔注射方式給藥。查表得知以人的注射劑量作為參照系數(shù)（A1=36）換算大鼠用藥劑量系數(shù)（A2=6），按照人體質(zhì)量（W1=60 Kg），大鼠體質(zhì)量（W2=0.2 Kg），人體每日靜脈注射參附或參麥注射液（D1=60 mL）計(jì)算[10-11]，200 g大鼠參麥注射液與參附注射液每天的給藥劑量D2=（D1/W1）×（A1/A2）×W2為1.2 mL，每天1次，共給藥15 d。模型組大鼠注射等容量的注射滅菌用水。

1.6 檢測(cè)方法與指標(biāo)

1.6.1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 用SonoScape-S2N型彩色多普勒超聲診斷儀，在二維超聲引導(dǎo)下用M型超聲經(jīng)胸骨左心室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD），求3個(gè)心動(dòng)周期的平均值，并按照Teichholtz公式計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室短軸縮短率（LVFS）。

1.6.2 血壓檢測(cè) 將大鼠放入一端用網(wǎng)狀鐵絲封住的加熱套筒內(nèi)，套筒溫度設(shè)置在38 ℃，用特制帆布裹住大鼠臀部并露出尾巴。加熱3～5 min后，將測(cè)壓儀套入距離尾根部3～5 cm處，開(kāi)始測(cè)壓。選取3 min內(nèi)連續(xù)測(cè)得收縮壓波動(dòng)范圍不超過(guò)5 mmHg的3組血壓值，并取3組收縮壓平均值做為每只大鼠的血壓監(jiān)測(cè)值。在飼養(yǎng)的20周內(nèi)，每15天測(cè)量大鼠血壓1次。

1.6.3 血清樣本制備及微觀指標(biāo)檢測(cè) 在取材前大鼠經(jīng)10%水合氯醛按4 mL/kg計(jì)量腹腔注射麻醉后，使用采血針和采血管給大鼠腹主動(dòng)脈取血，采血完畢常溫靜置20 min后，以3 500 r/min離心10 min，立即提取上清液分裝在離心管里，置-80 ℃冰箱里保存。待測(cè)時(shí)，先將血清室溫放置2 h后，1 000 r/min離心15 min，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）對(duì)血清樣本進(jìn)行NT-proBNP含量檢測(cè)。

1.6.4 心肌細(xì)胞染色 取出大鼠心臟后經(jīng)固定、脫水、包埋以及切片后，將心臟切片用蘇木精—伊紅染色法染色，在光鏡下以400倍觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，當(dāng)滿足方差齊性時(shí)，兩兩比較采用LSD法；方差不齊則采用Dunnetts T3法；P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況

造模期間，對(duì)照組15只大鼠全部存活，無(wú)一死亡；模型組15只大鼠死亡5只，剩余10只；參附組死亡8只，剩余7只；參麥組死亡7只，剩余8只；治療期間，各組大鼠均無(wú)死亡。

2.2 血壓監(jiān)測(cè)圖

從圖1可以看出，模型組、參附組和參麥組大鼠血壓從低于140 mmHg開(kāi)始逐步上升至200 mmHg，最終模型組穩(wěn)定在此階段，而從第120天開(kāi)始參附組和參麥組組內(nèi)平均血壓有所下降，或與飼養(yǎng)后期大鼠因死亡數(shù)量下降有關(guān)；而對(duì)照組大鼠血壓一直穩(wěn)定在140 mmHg左右。因此，可確定該模型組大鼠長(zhǎng)期存在高血壓，可能對(duì)心臟有損害。

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

觀察結(jié)果顯示（圖2），對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)清晰，心肌閏盤(pán)、橫紋清晰，心肌細(xì)胞核位于邊緣，核大小、形態(tài)正常；模型組心肌結(jié)構(gòu)模糊，心肌閏盤(pán)不清，橫紋消失，肌纖維呈波浪形排列，細(xì)胞間縫隙增大，心肌細(xì)胞水腫增大或溶解，出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞；與模型組比較，參附組改善作用不顯著，而參麥組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，無(wú)水腫等病理變化。

2.4 各組大鼠LVEF、LVFS和NT-proBNP比較

與對(duì)照組比較，模型組LVEF和LVFS值均降低（P<0.05），說(shuō)明成模質(zhì)量較好；與模型組比較，參附組LVEF和LVFS值明顯降低 （P<0.05），參麥組LVFS值升高（P<0.05）；與參附組比較，參麥組LVEF和LVFS值均升高（P<0.05）；與對(duì)照組比較，模型組大鼠NT-proBNP值升高（P<0.01），提示造模方法較好，模型較為成功；與模型組比較，參附組NT-proBNP值升高（P<0.01），參麥組NT-proBNP值降低 （P<0.01）。見(jiàn)表1。

3 討論

由于方劑與證型之間的多效性，一個(gè)證型可以用不止一首方治療后有確切的療效。又根據(jù)“以方測(cè)證”的理論，即依據(jù)方劑的功效或其組成藥物的功效推測(cè)或反證其對(duì)應(yīng)證候的屬性。不管運(yùn)用何種辨證方法，最后總要落實(shí)到一個(gè)證和一個(gè)或幾個(gè)與之相對(duì)應(yīng)的方劑上，方劑乃是根據(jù)證而立法選藥、配伍組合而成，證與方劑之間愈是絲絲入扣，療效就愈佳[12]。為了更合理確定動(dòng)物模型的中醫(yī)證型，所以在選擇治療藥物時(shí)，應(yīng)從藥物治療功效上將其所治療的中醫(yī)證型區(qū)分開(kāi)[13]。因此，我們選擇了參附注射液和參麥注射液作為對(duì)比治療藥物。參附注射液主要成分為紅參和附子，具有益氣溫陽(yáng)、回陽(yáng)救逆的功效，在臨床上常用于治療陽(yáng)虛證、陰竭陽(yáng)脫證患者；參麥注射液源自古方生脈散，為紅參和麥冬提取物，具有益氣復(fù)脈、養(yǎng)陰生津的功效，臨床上廣泛用于氣陰兩虛型患者。有研究表明[14-15]，參附注射液能提高充血性心力衰竭患者心輸出量、射血分?jǐn)?shù)，增強(qiáng)心臟的收縮功能，改善心功能不全的臨床癥狀和體征。參麥注射液則能改善心臟的舒張功能，同時(shí)也能改善心衰患者的射血分?jǐn)?shù)。

本模型通過(guò)長(zhǎng)期維持大鼠高血壓狀態(tài)，最終導(dǎo)致大鼠心臟損傷，從而引起心力衰竭，與人類高血壓心臟病造成的心力衰竭非常類似。多項(xiàng)研究表明高血壓心衰不同于普通心衰，它不僅伴隨血壓升高，而且多為射血分?jǐn)?shù)保留的心力衰竭[16-17]。NT-proBNP是當(dāng)前診斷心力衰竭最為準(zhǔn)確的生物學(xué)指標(biāo)，半衰期時(shí)間長(zhǎng)，體外穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24 h，在血液中有累積作用，且不受所選藥物的影響，因此有較高的靈敏度和特異度[18]。NT-proBNP水平受心肌張力強(qiáng)度影響，能反映心衰的嚴(yán)重程度，對(duì)預(yù)后有重要的參考價(jià)值[19]。結(jié)合模型組大鼠血壓一直保持在180 mmHg以上，并且心肌細(xì)胞溶解斷裂情況嚴(yán)重，射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率降低，NT-proBNP水平升高，提示模型組大鼠存在因高血壓導(dǎo)致的心肌細(xì)胞重塑，左室舒張功能減退，射血功能降低符合心衰的病理變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，參附注射液組治療后NT-proBNP水平升高，LVEF和LVFS降低，心肌細(xì)胞染色結(jié)果與模型組對(duì)比差異不明顯，說(shuō)明病情不但沒(méi)有好轉(zhuǎn)，反而比模型組加重；而參麥注射液組NT-proBNP比模型組降低，大鼠LVEF、LVFS和心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)果明顯好轉(zhuǎn)，證實(shí)參麥注射液對(duì)高血壓心衰有良好的治療效果而參附注射液沒(méi)有，因此，我們從“以方測(cè)證”角度說(shuō)明了該模型不屬于心陽(yáng)虛證，最可能是心氣陰虛證；LVEF值保留及血壓升高可能是應(yīng)用參附注射液的禁忌指標(biāo)。結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果[20-22]，說(shuō)明通過(guò)不同方式造成的大鼠心衰模型確實(shí)存在中醫(yī)證型的差異，為中醫(yī)證候模型研究提供了新的思路，也是對(duì)我們課題組前期基于不同心衰模型的證本質(zhì)研究的重要補(bǔ)充。

本次實(shí)驗(yàn)仍有不足之處。心衰后水液代謝明顯障礙，或由于長(zhǎng)期大量攝入鈉鹽極易引起腎小球?yàn)V過(guò)功能降低、近端小管及遠(yuǎn)端小管重吸收能力減弱導(dǎo)致大量蛋白丟失、血容量下降、腸道蠕動(dòng)減弱[23]，以至于大鼠生命后期體格瘦小，腹部膨隆，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)明顯腸梗阻，這也是飼養(yǎng)后期大鼠死亡的主要原因，與臨床中腎衰竭合并腸梗阻的病理相符[24]，值得深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] BUI A L， HORWICH T B， FONAROW G C. Epidemiology and risk profile of heart failure[J]. Nat Rev Cardiol，2011，8（1）：30-41.

[2] 王 文，朱曼璐，王擁軍，等.《中國(guó)心血管病報(bào)告2012》概要[J].中國(guó)循環(huán)雜志，2013，28（6）：408-412.

[3] STEWART S， EKMAN I， EKMAN T， et al. Population Impact of Heart Failure and the Most Common Forms of Cancer A Study of 1162309 Hospital Cases in Sweden （1988 to 2004）[J]. Circulation： Cardiovascular Quality and Outcomes， 2010， 3（6）： 573-580.

[4] ROSS J S， CHEN J， LIN Z， et al. Recent national trends in readmission rates after heart failure hospitalization[J]. Circulation： Heart Failure， 2010， 3（1）： 97-103.

[5] 楊 萍，李 華，章永南，等.參附注射液治療舒張性心力衰竭的臨床療效及機(jī)制研究[J].中藥藥理與臨床，2014，30（4）：116-119.

[6] 褚慶民，李 榮，張 瑤，等.參麥注射液治療氣陰兩虛型舒張性心力衰竭療效觀察[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（4）：305-307.

[7] 陳弘東，謝雁鳴，王連心，等.參麥注射液輔助治療慢性心力衰竭的有效性及安全性系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（18）：3650-3661.

[8] 侯雅竹，毛靜遠(yuǎn)，王賢良，等.參附注射液治療心力衰竭的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)循證醫(yī)學(xué)雜志，2011，11（3）：292-299.

[9] 李欣春，梁 昊，胡志希，等.高血壓心力衰竭大鼠動(dòng)物模型的研制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（3）：245-248.

[10] 嚴(yán)治濤，羅文利，黃金梅，等.不同劑量參附注射液治療慢性心力衰竭的臨床療效觀察[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（2）：636-640.

[11] 楊 靖，李 霖，謝雁鳴，等.參附注射液治療冠心病臨床用藥方案實(shí)效研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（18）：3099-3103.

[12] 張?zhí)m鳳，王永炎.方證對(duì)應(yīng)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（1）：8-10.

[13] 盧林竹，胡志希，李 琳，等.“以方測(cè)證”法在動(dòng)物模型研究中的運(yùn)用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（5）：570-573.

[14] 賀澤龍，鄒曉玲.參附注射液對(duì)充血性心力衰竭患者血流動(dòng)力學(xué)的影響及機(jī)理探討[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2001，21（5）：386-387.

[15] 王燕麗，劉 捷，張光泰.999參麥注射液治療左室舒張功能不全60例[J].遼寧中醫(yī)雜志，1999（11）：508-509.

[16] KLOTZ S， HAY I， ZHANG G， et al. Development of heart failure in chronic hypertensive Dahl rats： focus on heart failure with preserved ejection fraction[J]. Hypertension， 2006，47（5）：901-911.

[17] KOKUBO M， UEMURA A， MATSUBARA T， et al. Noninvasive evaluation of the time course of change in cardiac function in spontaneously hypertensive rats by echocardiography[J]. Hypertens Res， 2005，28（7）：601-609.

[18] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)，中華心血管病雜志編輯委員會(huì).中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014[J].中華心血管病雜志，2014，42（2）：98-122.

[19] GERGEI I， KR？魧MER B K， SCHARNAGL H， et al. Propeptide big-endothelin， N-terminal-pro brain natriuretic peptide and mortality. The Ludwigshafen risk and cardiovascular health （LURIC） study[J]. Biomarkers， 2017，22（3/4）：315-320.

[20] 胡志希，吳 濤，李欣春，等.基于中藥制劑干預(yù)心肌梗死心衰大鼠的中醫(yī)證型研究[A].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)診斷專業(yè)委員會(huì).中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)診斷專業(yè)委員會(huì)第十次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C].河北秦皇島：中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)，2016：107-114.

[21] 胡思遠(yuǎn)，殷宏亮，李欣春，等.運(yùn)動(dòng)康復(fù)聯(lián)合參附注射液對(duì)心肌病心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（7）：715-718.

[22] 董文波，胡思遠(yuǎn)，吳 濤，等.參附注射液與參麥注射液對(duì)阿霉素誘導(dǎo)慢性心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響[A].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)診斷專業(yè)委員會(huì).第九次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合診斷學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C].北京：中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)，2015：4.

[23] NERBASS F B， PECOITS-FILHO R， MCINTYRE N J， et al. High sodium intake is associated with important risk factors in a large cohort of chronic kidney disease patients[J]. Eur J Clin Nutr， 2015， 69（7）：786-790.

[24] 洪漢利，陳統(tǒng)清，許玉燕，等.腎病綜合征并發(fā)低位小腸梗阻1例報(bào)告[J].吉林醫(yī)學(xué)，2014，35（2）：444-445.