蔡蔚 謝海平 龍蠡 謝曉 楊華偉

〔摘要〕 目的 研究馬歸液對腺性膀胱炎模型大鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、表皮生長因子-β（epidermal growth factor-β， EGF-β）的影響機(jī)制。方法 采用膀胱灌注DH5？琢大腸桿菌溶液的方法建立腺性膀胱炎大鼠模型，將模型大鼠分為模型組（灌注生理鹽水，1周1次）、馬歸液1組（灌注馬歸液，1周1次）、馬歸液2組（灌注馬歸液，1周2次）、吡柔比星組（灌注吡柔比星，1周1次），連續(xù)干預(yù)8周后對大鼠膀胱進(jìn)行病理學(xué)檢查，免疫組化法檢測TGF-β1、EGF-β的表達(dá)。結(jié)果 病理學(xué)顯示馬歸液1組和馬歸液2組大鼠的膀胱黏膜恢復(fù)正常。與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組和馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值、蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1平均吸光度值、蛋白表達(dá)降低、EGF-β平均吸光度值、蛋白表達(dá)與吡柔比星組相近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1平均吸光度值、蛋白表達(dá)與吡柔比星組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β平均吸光度值、蛋白表達(dá)高于吡柔比星組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值、蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 馬歸液能促進(jìn)腺性膀胱炎大鼠膀胱炎性組織的修復(fù)，其機(jī)制可能與馬歸液對TGF-β1、EGF-β的調(diào)控作用有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 馬歸液；腺性膀胱炎；轉(zhuǎn)化生長因子β1；表皮生長因子β

〔中圖分類號〕R285.5；R256.52 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.007

〔Abstract〕 Objective To study the mechanism of the effect of Magui Liquid on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） and epidermal growth factor-β （EGF-β） in a rat model of glandular cystitis. Methods A rat model of glandular cystitis was established by bladder infusion with Escherichia coli strain DH5α solution. The rats were divided into model group （infusion with saline once a week）， Magui Liquid 1 group （infusion with Magui Liquid once a week）， Magui Liquid 2 group （infusion with Magui Liquid twice a week）， and pirarubicin group （infusion with pirarubicin once a week）. The rats received pathological examinations after 8 continouse weeks of drug intervention. Immunohistochemistry was used to measure the expression of TGF-β1 and EGF-β. Results Pathological examinations showed that the bladder mucosa returned to normal in the Magui Liquid groups. The pirarubicin group and the Magui Liquid groups had significantly higher mean absorbance and expression levels of EGF-β and TGF-β1 than the model group （P<0.01）. There were no significant differences in mean absorbance or expression levels of EGF-β or TGF-β1 between the pirarubicin group and the Magui Liquid 1 group （P>0.05）. There were also no significant differences in mean absorbance or expression level of TGF-β1 between the pirarubicin group and the Magui Liquid 2 group （P>0.05）. However， the Magui Liquid 2 group had significantly higher mean absorbance and expression level of EGF-βthan the pirarubicin group （P<0.01）. The Magui Liquid 2 group had significantly higher mean absorbance and expression levels of EGF-β and TGF-β1 than the Magui Liquid 1group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Magui Liquid can promote the repair of the inflammatory tissue in rats with glandular cystitis， probably by regulation of TGF-β1 and EGF-β.

〔Keywords〕 Magui Liquid； glandular cystitis； transforming growth factor-β1； epidermal growth factor-β

腺性膀胱炎是膀胱黏膜增生性病變，多伴有非特異性感染，與膀胱癌有著密切聯(lián)系[1]。有學(xué)者[2]認(rèn)為腺性膀胱炎是膀胱癌的潛在癌前病變。目前腺性膀胱炎的治療多為膀胱黏膜電切聯(lián)合化療藥物膀胱灌注，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，且膀胱灌注也易出現(xiàn)膀胱刺激征，患者難以耐受。近年來，本課題組臨床使用馬歸液膀胱灌注治療腺性膀胱炎取得了較好的效果[3]。本研究以腺性膀胱炎大鼠模型為研究對象，觀察自制馬歸液對腺性膀胱炎的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 實驗動物

成年雌性SD大鼠62只，體質(zhì)量（220±10）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（湘）2011-0003，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗中心喂養(yǎng)。所有動物均給予自由飲水，普食喂養(yǎng)，適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物

吡柔比星藥液制備：吡柔比星凍干粉針劑30 mg，加注射用水配成50 mL溶液備用（吡柔比星，10 mg/支，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1505c4）。馬歸液：由馬鞭草30 g，當(dāng)歸20 g，赤芍20 g，生黃芪20 g四味藥物制備而成，以上飲片均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制劑中心提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)教研室鑒定符合藥典規(guī)定。大腸埃希菌溶液（濃度在108～109 CFU/100 ？滋L）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物室提供。25%烏拉坦溶液，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 特殊藥品制作

大腸埃希菌溶液的制備：在無菌條件下，從-70 ℃冰箱取出DH5α大腸埃希菌菌種，挑起菌種接種在裝有5 mL LB培養(yǎng)基的無菌離心試管中，置于37 ℃恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速150 r/min。10 h后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，大腸埃希菌溶液的濃度應(yīng)保持在108～109 CFU/100 ？滋L。馬歸液的制備：將當(dāng)歸冷浸0.5 h，用水蒸氣蒸餾提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另器保存，藥渣與馬鞭草、赤芍、黃芪加水煎煮3次，加水量分別為藥材量的10倍、8倍、8倍，第1次煎煮2 h，第2、3次各煎煮1.5 h，合并煎液，濾過，濾液與上述水溶液合并，靜置24 h，濾過，濃縮至近50 mL、藥物濃度為1.8 g/mL，加入適量防腐劑與當(dāng)歸揮發(fā)油，調(diào)整總?cè)萘恐?0 mL，攪勻，灌封，滅菌，即得。

1.4 試劑與主要儀器

SABC試劑盒，TGF-？茁1抗體（批號：11A24），EGF-？茁抗體（批號：BA0049），均購自武漢博士德生物公司。pv-9000二步法免疫組化檢測試劑盒（購自北京中杉金橋公司，批號201502）。LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；S2-93自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；KD2258型石蠟切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Motic B5 顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)公司）；OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡、H-600型透射電子顯微鏡（日本）。

2 方法

2.1 腺性膀胱炎大鼠造模方法[4-5]

將成年雌性SD大鼠62只，完全隨機(jī)分為3組：空白組（10只）、生理鹽水灌注組（10只）和造模組（42只）。造模組：膀胱灌注DH5α大腸桿菌溶液（108～109 CFU/100 ？滋L）0.2 mL，隔日1次，共20次；生理鹽水灌注組：膀胱灌注生理鹽水，隔日1次，共20次；空白組：不行膀胱灌注。用25%烏拉坦按1.0 g/kg劑量腹腔注射麻醉SD大鼠，仰臥固定大鼠，常規(guī)消毒會陰部。將無菌硬膜外導(dǎo)管用無菌液體石蠟潤滑后，提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道1 cm左右。通過抽吸導(dǎo)管排除大鼠殘余尿液，分別用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL無菌生理鹽水、大腸桿菌溶液，然后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。50 d后每組隨機(jī)選取大鼠2只，處死取出膀胱，行H-600型透射電子顯微鏡超微病理學(xué)檢測，造模組大鼠膀胱黏膜固有層出現(xiàn)炎性浸潤、Brunn巢、囊腔，證實造模成功。

2.2 分組與給藥

（1）分組方法：將造模組造模成功的40只大鼠完全隨機(jī)分成4組：模型組、馬歸液1組、馬歸液2組、吡柔比星組。模型組：每周一膀胱灌注生理鹽水0.2 mL；馬歸液1組：每周一膀胱灌注馬歸液0.2 mL；馬歸液2組：每周一、周五各膀胱灌注1次馬歸液0.2 mL；吡柔比星組：每周一膀胱灌注吡柔比星注射液0.2 mL。每組均干預(yù)8周。（2）操作方法：用25%烏拉坦按1.0 g/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，將無菌硬膜外導(dǎo)管用無菌液體石蠟潤滑，再提起尿道外口的皮膚，沿尿道后壁插入尿道1 cm。通過抽吸導(dǎo)管排除大鼠殘余尿液，分別用1 mL注射器向大鼠膀胱注入0.2 mL無菌生理鹽水、馬歸液、吡柔比星注射液。最后退出導(dǎo)管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。

2.3 標(biāo)本切取

給藥結(jié)束后將各組大鼠用25%烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉，劑量為1.0 g/kg，然后進(jìn)行斷頸處死，取仰臥位，固定四肢，剪開會陰部皮膚，提起大鼠膀胱底部，分離至尿道近端剪斷，取出膀胱。

2.4 各組標(biāo)本指標(biāo)檢測

觀察膀胱的大體形態(tài)，迅速用10%甲醛溶液將膀胱體部和膀胱三角固定。用10%甲醛溶液將標(biāo)本定型、然后流水沖洗、酒精脫水，使用二甲苯將標(biāo)本進(jìn)行兩次透明，然后標(biāo)本浸蠟，用硬蠟將浸蠟后的標(biāo)本包埋，并做好標(biāo)記。對包埋好的標(biāo)本修切，進(jìn)而連續(xù)常規(guī)切片、展片、進(jìn)行HE染色。切片做好后，分別置于100倍、200倍、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察膀胱黏膜固有層是否有炎性細(xì)胞浸潤、腺體樣結(jié)構(gòu)、囊腔和Brunn巢結(jié)構(gòu)。各組大鼠膀胱免疫組化檢測嚴(yán)格參照試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，分別檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、表皮生長因子-β（epidermal growth factor-β，EGF-β）的表達(dá)，采用HMIAS高清晰度醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)檢測TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值。

2.5 統(tǒng)計方法

所有實驗數(shù)據(jù)均以“x±s”表示，采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，兩組間比較用SNK-q檢驗，多組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 病理切片HE染色鏡下觀察結(jié)果

模型組：可見膀胱黏膜上皮層變薄，固有層排列混亂，基底層空泡樣變，局部有炎性浸潤，血管增多，可見腺體樣結(jié)構(gòu)。吡柔比星組：可見膀胱黏膜上皮層變厚，固有層排列混亂，基底層空泡樣變，血管增多，未見炎性浸潤。馬歸液1組、馬歸液2組：膀胱黏膜完好，未見壞死、炎性浸潤。見圖1。

3.2 各組大鼠TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值比較

與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組和馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值明顯升高（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1平均吸光度值降低、EGF-β平均吸光度值與吡柔比星組相近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1平均吸光度值與吡柔比星組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β平均吸光度值高于吡柔比星組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β的平均吸光度值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠TGF-β1、EGF-β蛋白表達(dá)比較

與模型組比較，吡柔比星組、馬歸液1組、馬歸液2組TGF-β1、EGF-β蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與吡柔比星組比較，馬歸液1組TGF-β1蛋白表達(dá)降低、EGF-β蛋白表達(dá)與吡柔比星組相近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與吡柔比星組比較，馬歸液2組TGF-β1蛋白表達(dá)與吡柔比星組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但馬歸液2組EGF-β蛋白表達(dá)高于吡柔比星組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與馬歸液1組比較，馬歸液2組TGF-β1、EGF-β蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2、圖2-3。

4 結(jié)論

腺性膀胱炎是一種以尿頻、尿急、恥骨上方脹痛及夜尿頻繁等為主要表現(xiàn)的慢性膀胱疾患，目前腺性膀胱炎的病因尚未完全明確[5]，部分研究表明腺性膀胱炎是一種少見的腫瘤炎性病變，被認(rèn)為是一種癌前病變，具有演變?yōu)榘螂紫侔┑膬A向[6]。而非可控性炎癥是指在一些不確定因素的影響下，持續(xù)或低強(qiáng)度的炎癥刺激使靶組織處于長期或過度反應(yīng)，炎癥無法從抗感染、修復(fù)組織損傷模式下轉(zhuǎn)變成為穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行。長期慢性的非可控性炎癥可以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，并在腫瘤發(fā)病進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸中起到重要作用[7-8]。非可控性炎癥感染可激活和募集大量白細(xì)胞，分泌各種細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）[9]、表皮生長因子（EGF）[10]、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等，一起組成新的炎癥微環(huán)境，另外炎細(xì)胞也可分泌蛋白溶解酶，這些炎癥介質(zhì)可在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并刺激腫瘤細(xì)胞生長、血管和淋巴管生成以及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。

TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族成員，能使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化，TGF-β1對正常細(xì)胞及癌變早期細(xì)胞具有抑制作用，而TGF-β1被認(rèn)為是最強(qiáng)的致纖維化因子[11]。腺性膀胱炎的發(fā)生發(fā)展與TGF-β1具有密切關(guān)系，TGF-β1參與了膀胱形態(tài)的變化，在膀胱炎癥及纖維化的進(jìn)程中也有著重要作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可依賴Smad2/3方式介導(dǎo)膀胱上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)纖維細(xì)胞合成膠原纖維以利于損傷區(qū)修復(fù)[12]。而EGF是人體一種很強(qiáng)的促有絲分裂因子，能促進(jìn)組織細(xì)胞增生與分裂，增強(qiáng)表皮細(xì)胞的活力，加速皮膚、黏膜的創(chuàng)傷愈合和損傷修復(fù)，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，在參與多種器官纖維化過程中起重要作用。EGF和TGF通過結(jié)合相同的表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor， EGFR）刺激細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，在創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生等過程中具有重要功能[12-13]。膀胱黏膜修復(fù)和愈合需要依靠各類細(xì)胞生長因子的相互作用，其過程是極為復(fù)雜的。EGF具有刺激黏膜上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)和DNA合成，促進(jìn)上皮細(xì)胞增生，改善黏膜血循環(huán)和增強(qiáng)黏膜屏障，在黏膜的損傷修復(fù)過程中及維持黏膜的完整性發(fā)揮著重要作用。TGF屬于炎性細(xì)胞趨化因子，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向傷口聚集，促進(jìn)創(chuàng)面小血管的生成、肉芽組織生長和表皮形成。TGF-β1與EGF-β相互作用，可調(diào)控機(jī)體局部炎癥發(fā)生、發(fā)展的趨勢，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。在炎癥發(fā)生發(fā)展期間，TGF-β1、EGF-β大量釋放，參與炎性組織的修復(fù)。

腺性膀胱炎屬中醫(yī)學(xué)“淋證”范疇，多由濕熱之邪下注膀胱，膀胱氣化失司，或熱結(jié)于下焦，致尿頻、尿急、小腹脹痛、尿血等諸證。根據(jù)“久病致虛、久病致瘀”理論，結(jié)合長期的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣虛血瘀在腺性膀胱炎中較為常見，治療應(yīng)以清熱利濕、益氣活血為法[3]。本課題采用的自制中藥馬歸液具有“清熱利濕通淋、益氣活血化瘀、消腫散結(jié)抗癌”之功效，由馬鞭草、當(dāng)歸、赤芍、黃芪四味中藥經(jīng)先進(jìn)工藝制成，諸藥合用，具有抗菌消炎、止痛止血、抗癌抗腫瘤、促進(jìn)愈合等作用[3，14]。

本實驗研究結(jié)果顯示，與模型組比較，馬歸液治療后的大鼠模型TGF-β1、EGF-β平均吸光度值、蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05），結(jié)合病理學(xué)結(jié)果，馬歸液治療后的腺性膀胱炎大鼠模型的膀胱黏膜恢復(fù)正常，說明馬歸液具有調(diào)節(jié)腺性膀胱炎大鼠模型TGF-β1、EGF-β蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)膀胱組織修復(fù)，提高腺性膀胱炎的愈合率的效果。馬歸液2組的TGF-β1、EGF-β蛋白表達(dá)明顯高于馬歸液1組，說明馬歸液2組療效更佳。

綜上所述，馬歸液能促進(jìn)腺性膀胱炎大鼠膀胱炎性組織的修復(fù)，其機(jī)制可能與馬歸液對TGF-β1、EGF-β的調(diào)控作用有關(guān)。但是腺性膀胱炎的病理機(jī)制尚十分復(fù)雜，馬歸液對腺性膀胱炎的相關(guān)信號通路的影響還有待進(jìn)一步研究。

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