曲艷麗 劉治民 孫冶 劉雨過 楊建龍

中圖分類號(hào) R28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）08-1057-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.11

摘 要 目的： 建立山紫菀藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法： 采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材樣品進(jìn)行定性鑒別；測(cè)定藥材樣品水分、灰分、浸出物的含量；采用高效液相色譜法測(cè)定藥材樣品中阿魏酸的含量，色譜柱為Waters SunFire C18， 流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為319 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。結(jié)果：山紫菀的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。藥材樣品水分為7.6%～9.4%，總灰分為11.7%～19.6%，酸不溶性灰分為5.9%～14.1%，浸出物為25.4%～37.5%。阿魏酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.021 2～0.636 8 ?g（r=0.999 9）；定量限為2.25 ng，檢測(cè)限為0.75 ng；中間精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3.0%；加樣回收率為97.81%～100.59%（RSD=1.02%，n=9）。結(jié)論：初步擬定山紫菀藥材水分不得過10.0%，總灰分不得過19.0%，酸不溶性成分不得過12.0%，浸出物不得少于25.0%，阿魏酸含量不得少于0.1%；所建標(biāo)準(zhǔn)可為山紫菀藥材的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 山紫菀；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；阿魏酸； 水分；灰分；浸出物；薄層色譜法；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Ligularia fischeri. METHODS： TLC was used for qualitative identification of samples. The contents of moisture， ash and extract were determined. The content of ferulic acid in samples was determined by HPLC. The determination was performed on Waters SunFire C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （13 ∶ 87，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 319 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 ?L. RESULTS： TLC spots were clear and well-separated without interference from genitive control. The moisture， total ash， acid-insoluble ash and extract of samples were 7.6%-9.4%， 11.7%-19.6%， 5.9%-14.1% and 25.4%-37.5%， respectively. The linear range of ferulic acid were 0.021 2-0.636 8 ?g（r=0.999 9）. limited of quantation was 2.25 ng， the limited of detection was 0.75 ng. RSDs of intermediate precision， reproducibility and stability tests were all lower than 3.0%. The recoveries ranged 97.81%-100.59%（RSD=1.02%，n=9）. CONCLUSIONS： The moisture， total ash and acid-insoluble ash of samples are no more than 10.0%， 19.0%， 12.0%； the extract and the content of ferulic acid are no less than 25.0% and 0.1%. Established standard can provide reference for quality control of L. fischeri.

KEYWORDS Ligularia fischeri； Quality standard； Ferulic acid； Moisture； Ash； Extract； TLC； HPLC

山紫菀為地方習(xí)用藥材，始載于宋代蘇頌所著的《圖經(jīng)本草》，具有“溫肺下氣，消痰止嗽”的功效，可用于風(fēng)寒咳嗽氣喘、虛勞咳吐膿血的治療，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎作用[1]。山紫菀主要分布于我國(guó)四川省、湖北省、貴州省和東北地區(qū)等，其基源也不統(tǒng)一。東北地區(qū)習(xí)用的山紫菀來源為菊科植物蹄葉橐吾[Ligularia fischeri （Ledeb.） Turcz.]的干燥根及根莖，多生于林下或林緣陰濕草地[2]。吉林省內(nèi)蹄葉橐吾分布廣泛，資源豐富，延邊地區(qū)民眾常將其嫩葉“馬蹄葉”作為山野菜食用。但1997年版《吉林省藥品標(biāo)準(zhǔn)》及2009年版《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊(cè)）中收載“山紫菀”檢驗(yàn)項(xiàng)目較少，且沒有含量測(cè)定項(xiàng)，無法有效地控制山紫菀藥材的質(zhì)量。已有報(bào)道多集中于研究山紫菀藥材的性狀特征和顯微鑒別[3-4]，而對(duì)其薄層色譜鑒別、水分、灰分、浸出物和含量測(cè)定等項(xiàng)未作研究。筆者采集10批山紫菀藥材，對(duì)其薄層色譜、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、含量測(cè)定等項(xiàng)目進(jìn)行了系統(tǒng)研究，制定了以山紫菀對(duì)照藥材為對(duì)照的薄層色譜鑒別和以阿魏酸為對(duì)照品的含量測(cè)定方法，旨在為山紫菀藥材質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；HP1100型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器（美國(guó)HP公司）；2010C型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；TU-1900型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；GR-202型電子分析天平（日本AD公司）；KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SX2-4-10型高溫箱型電爐（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110773-201614，純度：99.0%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

10批山紫菀藥材采自吉林省琿春、圖們、汪清等地（見表1），經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張景龍教授和通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定為真品（以編號(hào)1為對(duì)照藥材）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取藥材樣品1 g，粉碎，加稀乙醇（529→1 000，下同）50 mL，浸泡12 h后回流提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即得供試品溶液。取山紫菀對(duì)照藥材1 g，按上述供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。量取稀乙醇50 mL，放置12 h后加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即得陰性對(duì)照溶液。按 2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[5]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵溶液-1%鐵氰化鉀溶液（1 ∶ 1，V/V）（臨用新配），放置15 min后置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

2.2 水分、灰分、浸出物檢測(cè)

2.2.1 水分 取各批次藥材樣品粉末適量，精密稱定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則0832水分測(cè)定法”的第二法（烘干法）[5]測(cè)定藥材樣品水分，每批平行測(cè)定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品水分為7.6%～9.4%，平均值為8.6%。初步擬定山紫菀藥材水分不得過10.0%。

2.2.2 總灰分 取各批次藥材樣品粉末適量，精密稱定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則2302總灰分測(cè)定法”[5]測(cè)定藥材樣品總灰分，每批平行測(cè)定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品總灰分為11.7%～19.6%，平均值為16.1%。初步擬定山紫菀藥材總灰分不得過19.0%。

2.2.3 酸不溶性灰分 取各批次藥材樣品粉末適量，精密稱定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則2302酸不溶性灰分測(cè)定法”[5]測(cè)定藥材樣品酸不溶性灰分，每批平行測(cè)定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品酸不溶性灰分為5.9%～14.1%，平均值為10.3%。初步擬定山紫菀藥材酸不溶性灰分不得過12.0%。

2.2.4 浸出物 取各批次藥材樣品粉末適量，精密稱定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則2201醇溶性浸出物測(cè)定法熱浸法”[5]，以25%乙醇溶液為溶劑測(cè)定藥材樣品醇溶性浸出物，每批平行測(cè)定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品醇溶性浸出物為25.4%～37.5%，平均值為30.5%。初步擬定山紫菀藥材醇溶性浸出物不少于25.0%。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：319 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L[6-7]。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量，加70%甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為21.2 ?g/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過3號(hào)篩）約0.25 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入含0.5%氫氧化鈉溶液的70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：300 W，頻率：45 kHz） 處理30 min后80 ℃加熱回流2 h，用含0.5%氫氧化鈉溶液的70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過；精密吸取續(xù)濾液5 mL，置于10 mL棕色量瓶中，精密加入0.1 mol/L鹽酸溶液4 mL，搖勻，加70%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 缺藥材樣品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖2。結(jié)果，理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)應(yīng)不低于3 000；分離度>1.5，基線分離良好。

2.3.6 專屬性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在與阿魏酸對(duì)照品保留時(shí)間相同處無色譜峰干擾，說明專屬性良好。

2.3.7 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、30 ?L，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以阿魏酸進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=5 651.2x+4.550 4（r=0.999 9）。結(jié)果表明，阿魏酸檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.021 2～0.636 8 ?g。

2.3.8 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限為2.25 ng；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限為0.75 ng。

2.3.9 中間精密度試驗(yàn) 取同一批藥材樣品（批號(hào)：3）適量，由3個(gè)不同操作人員，使用3臺(tái)不同型號(hào)的HPLC儀（Agilent1260、HP1100、Shimadzu 2010C），分別在不同日期按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量平均值分別為0.195%、0.198%、0.193%，總平均值為0.20%，RSD為1.29%，說明中間精密度良好。

2.3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：3）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸峰面積的RSD為1.90%（n=5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.11 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：3）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量平均值為0.20%，RSD為2.12%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.12 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（編號(hào)：3）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的阿魏酸對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.3.13 耐用性試驗(yàn) （1）色譜柱考察。取藥材樣品（編號(hào)：1）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件[色譜柱分別為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、SunFire （250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Shimadzu Shim-pack vp-ods（250 mm×4.6 mm，5 ?m）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量分別為0.206%、0.196%、0.201%，平均值為0.201%，RSD為2.49%，表明本色譜條件在一定色譜柱變動(dòng)情況下耐用。（2）流動(dòng)相考察。取藥材樣品（編號(hào)：8）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件[流動(dòng)相分別為乙腈-0.1%磷酸溶液（13 ∶ 87，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（12 ∶ 88，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（11 ∶ 89，V/V）]進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量分別為0.133%、0.138%、0.137%，平均值為0.136%，RSD為1.95%，表明本色譜條件在一定流動(dòng)相變動(dòng)情況下耐用。（3）流速考察。取藥材樣品（編號(hào)：4）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件（流速分別為0.8、1.0、1.2 mL/min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量分別為0.149%、0.145%、0.147%，平均值為0.147%，RSD為1.37%，表明本色譜條件在一定流速變動(dòng)情況下耐用。（4）柱溫考察。取藥材樣品（編號(hào)：4）適量，再按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件（柱溫分別為30、35、40 ℃）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量分別為0.135%、0.139%、0.132%，平均值為0.135%，RSD為2.60%，表明本色譜條件在一定柱溫變動(dòng)情況下耐用。 （5）進(jìn)樣體積考察。取藥材樣品（編號(hào)：3）適量，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件（進(jìn)樣體積分別為5、10、20 ?L）進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，阿魏酸含量分別為0.148%、0.148%、0.149%，平均值為0.148%，RSD為0.39%，表明本色譜條件在一定進(jìn)樣體積變動(dòng)情況下耐用。

2.3.14 樣品含量測(cè)定 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，阿魏酸含量為0.08%～0.27%，差異較大?？紤]藥材樣品產(chǎn)地不同，生長(zhǎng)年限不同，參考10批藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果，建議山紫菀藥材含阿魏酸（按干燥品計(jì)）不得少于0.1%。

3 討論

薄層鑒別預(yù)試驗(yàn)中，筆者分別考察了甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）、乙醚-三氯甲烷-甲酸（1 ∶ 5 ∶ 0.1，V/V/V）、甲苯-甲醇-冰醋酸（30 ∶ 3 ∶ 1，V/V/V）、環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）[8-10]對(duì)展開結(jié)果的影響。結(jié)果表明，展開系統(tǒng)為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）時(shí)，薄層斑點(diǎn)數(shù)量較多且清晰，比移值適中，分離度較好。

預(yù)試驗(yàn)中，筆者按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“通則2201醇溶性浸出物測(cè)定法”，分別考察了以水為溶劑的熱浸法、冷浸法對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)也考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（25%、50%、75%、95%）、甲醇溶液（25%、50%、75%、100%）為溶劑時(shí)對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，以25%乙醇溶液為溶劑時(shí)，熱浸提取所得到的浸出物含量最高。

阿魏酸在植物中是以游離態(tài)及結(jié)合態(tài)兩種形式存在，甲醇回流提取30 min測(cè)得的游離態(tài)阿魏酸含量為0.007%，無太大意義；而結(jié)合態(tài)的阿魏酸在酸性、堿性、中性條件下均可水解生成阿魏酸，即使水浴加熱都可能不同程度水解生成阿魏酸。阿魏酸有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，在植物中二者共存，以反式為主，二者可以相互轉(zhuǎn)化；反式阿魏酸較穩(wěn)定，市場(chǎng)上提供的阿魏酸對(duì)照品均為反式阿魏酸，因此，本試驗(yàn)中測(cè)定的是反式結(jié)合態(tài)阿魏酸。阿魏酸在溶液酸堿度趨于中性時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，因此，筆者以含0.5%氫氧化鈉溶液的70%甲醇溶液提取后，溶液pH值為14，穩(wěn)定性較差，經(jīng)鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6～7，阿魏酸在此環(huán)境下相對(duì)穩(wěn)定。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可為山紫菀藥材的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2017-10-11 修回日期：2017-11-13）

（編輯：張 靜）