秦舒琴 李海云 宋靜茹 李典鵬

摘 要： 兩面針是我國民間常用的傳統(tǒng)中藥之一，從根部提取分離到的氯化兩面針堿是兩面針植物多種生物活性的主要有效成分。當前，直接從植物中提取分離有效成分的方法不僅回收率低、成本高，而且氯化兩面針堿存在水溶性差和生物利用度低的問題，因此大多學者致力于改造其結構以提高活性和利用度，同時探索高效經(jīng)濟的全合成方法以滿足研究和生產(chǎn)的需求。該文以國內外相關文獻為基礎，對氯化兩面針堿的提取、分離純化、結構化合物的全合成路線以及藥理活性機制的研究進展做一綜述，總結目前研究中存在的不足，并對今后的研究重點做出展望，旨在為今后深入研究兩面針堿及衍生物活性改造、解析作用機制、開發(fā)基于此結構的創(chuàng)新藥物分子等提供理論依據(jù)。

關鍵詞： 氯化兩面針堿， 提取， 全合成， 藥理活性

中圖分類號： Q946 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-3142（2018）09-1248-13

Abstract： Zanthoxylum nitidum， locally called ‘liangmianzhen， is one of the traditional Chinese medicines. Nitidine chloride isolated from the root of Z. nitidium is the main active consitutent of its biological activities. Nowadays， chemists commit themselves to modifing the structure of nitidine， exploring efficient and versatile total synthetic routes to the analogues and evaluating structure-activity relationship. In this review， we summarized the enormous efforts for separation to enhance extraction efficiency， numerous total synthetic methods according to the reaction types and various pharmacolo-gical activities of nitidine chloride on the basis of related literatures from home and abroad. Besides， the review also discussed the deficiencies of current researches and prospected the further research priority. We hope that this review can provide a theoretical basis for the following study of structural modification， of the concise synthetic route using readily available and inexpensive reagents， of the bioactive mechanism， and of exploiting new chemotherapy drugs.

Key words： nitidine chloride， extraction， total synthesis， pharmacological activity

兩面針（Zanthoxylum nitidum）又名入地金牛、蔓椒、雙面針等，為蕓香科花椒屬藤本植物，是我國民間常用的傳統(tǒng)中藥材之一，具有抗炎、抗真菌、抗氧化、抗HIV和抗腫瘤等多種生物活性（Arthur et al，1959；Hu et al，2006；Wang et al，2015；Cesari et al，2015）。在我國主要分布于華南地區(qū)，其中以廣西的資源最為豐富，為兩面針的道地藥材產(chǎn)區(qū)。

氯化兩面針堿（nitidine chloride）主要從兩面針植物的根部分離得到，是最主要的生物活性成分，以其作為模型的抗癌、抗炎化合物的研究開發(fā)受到許多藥物化學家的重視（Bai et al，2006；Kang et al，2014；Pan et al，2013）。關于兩面針堿的提取分離手段，全合成方法以及多種藥理活性與機制的研究已經(jīng)全方位展開（Liu et al，2012；Zhao et al，2017）。現(xiàn)對此研究進展進行綜述，并指出研究中存在的不足和進一步的研究重點，為兩面針植物資源的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 氯化兩面針堿的理化性質與

化學結構

氯化兩面針堿的分子式為C21H18ClNO4，熔點為275～276 ℃，淡黃色針狀晶體，可溶解于甲醇、乙醇，微溶于水，結構式見圖1。

2 氯化兩面針堿的提取

由于氯化兩面針堿屬于苯并菲啶生物堿，所以用于提取生物堿的方法同樣適用于氯化兩面針堿，主要有回流法、酶法、超聲提取法等。

2.1 回流法

在氯化兩面針堿的提取方法中，回流法的應用最廣泛，主要有醇回流和酸醇回流兩種方法。雷欣潮等（2011）以80%的乙醇回流提取，采用正交設計優(yōu)選出了最優(yōu)提取工藝。黃曉燕等（2011）對比了醇回流和酸醇回流法的提取效果，結果表明加酸回流較普通醇回流可以大大提高提取率，對改進兩面針堿的提取工藝有推進作用。趙森等（2015）采用80%的乙醇8倍量提取，同時加入鹽酸調節(jié)pH至5，最終總生物堿的提取率平均為12.8%，氯化兩面針堿的含量達到41 mg·g-1。酸醇回流能夠提高氯化兩面針堿的提取率，但提取時間長，加劇了對設備的酸腐蝕程度。曾淼洋等（2013，2014）對酸醇回流工藝進行了改良，采用了內部沸騰法，不僅萃取溫度降低，時間縮短，而且總酸醇的用量減少，減輕了對設備的腐蝕。

2.2 酶法

目前，生物堿大都是從植物中提取，由于利用纖維素酶可以首先破壞植物的細胞壁，所以提取有效成分是一種有效手段（劉紅軍和廖國玲，2007）。陸世惠和李秀霞（2013a）先用纖維素酶/果膠酶的混合酶對兩面針藥材進行酶解，再用酸醇回流法室溫浸漬提取，氯化兩面針堿的提取率為85.96%。酶預處理萃取法減少了提取次數(shù)和溶劑的用量，符合節(jié)能環(huán)保的生產(chǎn)要求。

2.3 超聲波輔助提取法

超聲波提取是利用超聲波產(chǎn)生的空化作用、熱效應、震動作用使植物細胞壁破裂，加速有機溶劑進入細胞內部，促使細胞中的生物堿溶解到溶劑中達到提取目的（郭孝武，1999）。目前，超聲波提取主要作為一種輔助方法應用于天然產(chǎn)物的提取分離中。陸世惠和李秀霞（2013b）先采用酶預處理，再用超聲提取，可以將氯化兩面針堿的提取率提高到90.26%。采用超聲-酶輔助半仿生提取，干膏的收率可以顯著提高，適合大生產(chǎn)應用（陸世惠等，2014）。李秀霞等（2015）采用半仿生-超聲法提取， 先用復合酶預處理，再采用枸櫞酸-三乙胺的60%乙醇提取溶劑超聲提取，氯化兩面針堿的得率為0.252%，這種方法可以克服純水緩沖液水溶性較差的問題，促使提取率升高。酸醇回流操作簡便，提取率高，但對設備的腐蝕問題不容忽視，對規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)不利。酶、超聲輔助提取法在保持提取率的同時摒棄了酸的使用，大大減少了溶劑的使用量，在解決腐蝕問題的同時更加環(huán)保。

3 氯化兩面針堿的分離純化

兩面針中的生物堿種類繁多，如白屈菜紅堿、茵芋堿、二氫白屈菜紅堿、鵝掌楸堿、氯化兩面針堿、氧化兩面針堿等。為了得到更加純凈的氯化兩面針堿，需要在提取粗品的基礎上進一步純化，該方面的研究報道較少。

3.1 結晶法

黃治勛和李志和（1980）、王玫馨（1980）對兩面針植物的甲醇提取液處理后靜止結晶，純化析出氯化兩面針堿晶體，但實驗過程中需要用到氯仿，對環(huán)境污染較大。

3.2 樹脂吸附法

盧凌春等（2010）采用Ls006陽離子樹脂，通過靜態(tài)吸附-解析的方法對氯化兩面針堿富集純化，純度在90%以上。曾淼洋等（2014）用732陽離子樹脂靜態(tài)吸附加酸內部沸騰法的提取液，超聲輔助解吸，解吸率在99%以上，氯化兩面針堿純度為94.5%。樹脂純化法效果突出、操作簡單、成本低，具有工業(yè)應用價值。

3.3 色譜法

黃艷等（2013）將兩面針根的浸膏用氯仿反復研磨，所得沉淀甲醇溶解先重結晶，粗品再二次重結晶后用高效液相色譜法分離純化，采用C-18色譜柱洗脫，得到純度大于98%的氯化兩面針堿，該樣品可作為質量控制和科研用的化學對照品。

4 氯化兩面針堿的全合成

目前，氯化兩面針堿成品主要從植物中提取分離，提取率低，價格昂貴，難以滿足系統(tǒng)研究的需要。為了解決這一難題，學者們致力于探索氯化兩面針堿的高效全合成方法，其中最關鍵的步驟是B環(huán)或C環(huán)的構筑。該文將按照成環(huán)的化學方法進行分類概述。

4.1 Friedel-Crafts反應

早在1978年，Cushman & Cheng（1978）發(fā)展了一條開創(chuàng)性的全合成路線，其中就有利用分子內的Friedel-Crafts反應構建C環(huán)（圖2：a）。中間體（1）先經(jīng)Arndt-Eistert反應、Wolff重排后發(fā)生Friedel-Crafts反應得到關鍵中間體（4），再經(jīng)過氫化鋰鋁還原、脫氫反應完成C環(huán)的構筑。Luo et al（2006）在合成N-去甲基兩面針堿時也利用了分子內的Friedel-Crafts反應（圖2：b），先通過鎳或鈀催化環(huán)化完成B環(huán)的構建得到中間體（7），再經(jīng)Swern氧化得到中間體（8），最后在酸性條件下發(fā)生Friedel-Crafts反應得到N-去甲基兩面針堿（9）。相較于Cushman路線。該路線的原料易得，摒棄了危險品重氮甲烷，路線短，收率大大提高。

4.2 苯炔法

苯炔法應用較早。Kessar et al（1988）通過苯炔環(huán)化法構建兩面針堿的B環(huán)（圖3）。中間產(chǎn)物（10）在強堿KNH2/NH3作用下生成苯炔中間體，進一步環(huán)加成、氧化后得到N-去甲基兩面針堿，但產(chǎn)率極低，為10%左右。之后，用LDA/THF在-78 ℃發(fā)生反應，收率明顯提高，但需要嚴格控制無氧環(huán)境，否則收率極低，甚至反應不發(fā)生。Martín et al（1993）提出利用分子間苯炔環(huán)加成法合成兩面針堿（圖4：a）。化合物（12）充當?shù)s二烯等價體與苯炔發(fā)生分子間[4+2]環(huán)加成反應構筑異喹啉類生物堿骨架，該路線選擇性好但產(chǎn)率不高。Perez et al（1993）利用吡喃酮衍生物與苯炔發(fā)生分子間Diels-Alder反應構建C環(huán)，產(chǎn)物（19）經(jīng)還原脫氫后可以得到兩面針堿（圖4：b）。2015年，Castillo et al（2015）發(fā)展了串聯(lián)法快速制備官能團化異喹啉骨架，可用于兩面針堿的全合成（圖5）。該合成路線原料易制備、反應條件溫和、收率中等。

4.3 自由基反應

Nakanishi & Suzuki（1999）通過自由基機制引發(fā)分子內的芳基-芳基偶聯(lián)構建B環(huán)（圖6）。在錫試劑和偶氮二異戊腈（AMBN）的引發(fā)下，中間體（22）發(fā)生芳基偶聯(lián)反應生成關環(huán)產(chǎn)物（23），進一步反應得到抗癌化合物NK 109。2001年，Moreno et al（2001）利用高價碘試劑（PIFA）引發(fā)自由基偶聯(lián)反應構建B環(huán)（圖7）。該方法步驟短、條件溫和、產(chǎn)率較高，但取代基對反應活性影響大，不具有普適性。2013年，De et al（2013）提出直接由叔丁醇鉀與有機小分子促進的分子內自由基偶聯(lián)反應來合成苯并菲啶類生物堿（圖8）。當?shù)由系娜〈鶠橥榛鶗r，得到二氫苯并菲啶結構，改變取代基為芳?；?，則一鍋反應發(fā)生芳基偶聯(lián)、氧化脫保護直接生成芳構化產(chǎn)物。該方法路線短，催化劑對環(huán)境友好，可用于多種生物堿的合成。

4.4 Bischler-Napieralski反應

Bischler-Napieralski環(huán)合反應是構建兩面針堿B環(huán)的常用方法之一。Geen et al（1998）采用三氯氧磷（POCl3）催化關鍵中間體（33）或（34）發(fā)生Bischler-Napieralski環(huán)合反應，分別得到N-去甲基兩面針堿和氯化兩面針堿，B-N環(huán)合反應收率在90%以上（圖9：a）。Saito et al（2001）改用固體光氣作為催化劑，降低了反應溫度，縮短了反應時間，后處理更容易（圖9：b）。

4.5 金屬催化

金屬催化是近幾年發(fā)展比較熱門的苯并菲啶生物堿的合成方法。Harayama et al（2005）最早在2005年發(fā)展了鈀催化的分子內芳基-芳基偶聯(lián)反應直接構筑氧化兩面針堿（圖10：a）。Xu et al（2015）在Suzuki的合成路線基礎進行了進一步改良，提出醋酸鈀催化分子內Heck偶聯(lián)，五步反應完成氯化兩面針堿的合成（圖10：b）。Enomoto et al（2010）提出金（Ⅰ）催化分子內氫胺化串聯(lián)反應，高收率完成兩面針堿B環(huán)和C環(huán)的構建（圖11）。L et al（2011）提出鈀催化串聯(lián)反應合成氧化苯并菲啶結構（圖12）。鄰碘苯甲酸甲酯衍生物（46）與N-雜雙環(huán)中間體（47）在二價鈀金屬和鋅試劑的聯(lián)合催化下發(fā)生開環(huán)耦合-關環(huán)反應，高收率得到產(chǎn)物（48）。該方法路線精簡、收率高。Blanchot et al（2011）采用芳香三氟甲基磺酸酯替代芳香碘化合物（圖13），在鈀催化下與N-硅基亞胺（52）發(fā)生串聯(lián)反應制備苯并菲啶衍生物，可以有效合成兩面針堿、NK 109等，總收率中等。

4.6 光化學反應

2015年，Jiang et al（2015）提出了一種新的方法，利用可見光在室溫下誘導酰肟產(chǎn)生亞胺自由基，進一步發(fā)生分子內芳香取代反應生成含氮雜環(huán)，高效合成多種官能團化的苯并菲啶衍生物（圖14）。近年來，越來越多有效合成兩面針堿的方法得到探索，為兩面針堿的全合成、構效關系及生物活性的研究提供了便利。在這些全合成路線中，一些反應路線過長，總收率較低；一些路線雖然縮短，關鍵步驟收率高，但存在原料制備復雜或試劑昂貴的缺陷。因此，尋找高效且經(jīng)濟的全合成路線制備兩面針堿及衍生物仍然是一個挑戰(zhàn)和研究熱點。

5 兩面針堿的藥理活性

氯化兩面針堿具有良好的生物活性，在抗腫瘤、鎮(zhèn)痛消炎、抗瘧疾、抗菌、抗HIV病毒、心血管等方面都有顯著作用。

5.1 抗腫瘤

近年來，國內外學者對兩面針堿的抗腫瘤作用和機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)其對肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等都有顯著功效。但作用機制尚存在爭議，主要包括抑制DNA拓撲異構酶，誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期和抑制DNA連接酶的活性等，可以通過調節(jié)多種信號通路（如ERK、JAK/STAT3、AKT等）抑制腫瘤細胞。

Fang et al（1993）和Wang et al（1993）研究表明氯化兩面針堿及其類似的苯并菲啶化合物為拓撲異構酶Ⅰ（topoisomerase I）的功能抑制劑，濃度為0.15～0.3 μmol·L-1時即可穩(wěn)定拓撲異構酶Ⅰ和DNA形成的共價二元復合物。黃怡等（2013）發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可使肝癌細胞SMMC-7721的E2F、RB基因的mRNA和E2F蛋白的表達明顯降低，阻滯肝癌細胞G1期向S期的轉變，抑制肝癌細胞的增殖，并誘導細胞的凋亡，細胞增殖的抑制率最大IC50為（1.05±0.12） mg·mL-1。Sun et al（2014）研究表明氯化兩面針堿能夠上調Bax/Bcl-2的比例，誘導腫瘤細胞的G2/M期阻滯從而誘導乳腺癌細胞的凋亡。劉華鋼等（2007）發(fā)現(xiàn)通過增加兩面針堿的濃度能顯著抑制KB細胞的增殖，低濃度時以G2/M期阻滯為主，中濃度時可誘導凋亡，高濃度時則以致其壞死為主。Lin et al（2014）對患有肝癌的小鼠給予氯化兩面針堿，發(fā)現(xiàn)腫瘤的體積和質量顯著減小，但小鼠的體重并無明顯的變化，證實了兩面針堿的抗肝癌活性；同時，他們的研究表明兩面針堿通過抑制STAT3、ERK和SHH多條信號通路，改變關鍵基因的表達從而抑制腫瘤細胞的繁殖并促使其凋亡。Zhai et al（2016）和Sun et al（2016）研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿能通過調控ERK信號通路改變關鍵基因的表達，抑制結腸癌細胞和卵巢癌細胞的增殖與遷移，并促使其凋亡。Cheng et al（2016）使用超過5 μmol·L-1的氯化兩面針堿作用U2OS骨肉瘤細胞24 h后，觀察到腫瘤細胞增殖、遷徙和侵襲能力均受到顯著抑制，并證實氯化兩面針堿的有效作用是通過AKT/GSK-3β/Snail信號通路完成的。Li et al（2017）開發(fā)了一種氯化兩面針堿的超分子試劑NC@CB[7]，相較于單體氯化兩面針堿，其對人體正常肝細胞LO2的IC50大大降低，但對乳腺癌細胞MCF-7的IC50提高很多，表明CB[7]超分子結構的參與能夠明顯減輕對肝細胞的毒性同時提高抗癌活性，為其它藥物的超分子配方打開新思路。

5.2 抗瘧疾

Jullian et al（2006）從Zanthoxylum rhoifolium中分離得到多種苯并菲啶類生物堿，發(fā)現(xiàn)兩面針堿對惡性瘧原蟲的活性最強，IC50

5.3 抗菌作用

兩面針堿對多種細菌、真菌具有抑制和殺滅的作用。Poeta et al（1999）在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿能夠有效抑制真菌的感染，效果與喜樹堿相當，是一類很有前景的抗真菌化合物。葉玉珊等（2013）對兩面針根中分離到的11種化合物進行了抗菌活性研究，結果發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿對六大類抗生素均耐藥的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有較強的殺菌活性。Zhang et al（2014）從花椒葉中的乙酸乙酯提取部分分離得到氯化兩面針堿，發(fā)現(xiàn)其對五種病原菌（Botrytis cinerea，Piricularia oryzae，Physalospora piricola，Glomerella cingulate and Venturia pyrina）的抗菌活性均超過了50%，其中對Glomerella cingulate的抑菌活性最強。Tavares et al（2014）證實兩面針堿對酵母菌的MIC值為6.25～25 μg·mL-1，抗真菌活性較強。Cesari et al（2015）研究發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿對芽孢桿菌ATCC 3584和化膿性鏈球菌ATCC 19615有明顯的殺菌和抑菌作用（MIC值分別為0.19、3.64 μmol·L-1）。

5.4 抗炎止痛作用

兩面針在民間常用于跌打損傷、消炎止痛。利用兩面針開發(fā)的口腔護理產(chǎn)品正是基于其在抗炎，鎮(zhèn)痛及止血方面的功效。劉紹華等（2005）對兩面針提取物進行了鎮(zhèn)痛、抗炎實驗，采用熱板法和扭體法研究提取物對小鼠的鎮(zhèn)痛作用，用二甲苯致小鼠耳廓腫脹法及腹腔染料滲出法來研究抗炎作用，結果表明兩面針提取物對小鼠具有非常顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎作用。Wang et al（2012）采用脂多糖誘導的Raw264.7小鼠巨噬細胞研究兩面針堿的體外抗炎機制，研究表明氯化兩面針堿通過抑制MAPK的磷酸化和p65的轉錄，能夠在RNA和蛋白質水平上大幅度的減少促炎細胞因子如TNF-a、IL-1b、IL-6的生成，具有顯著的抗炎作用，這一發(fā)現(xiàn)為炎癥疾病的治療提供了新的前景。Wang et al（2016）在帕金森病模型研究中發(fā)現(xiàn)，兩面針堿能夠抑制Jak2-Stat3信號通路，增強aβ晶體與p-Stat3之間的結合活性，從而抑制小膠質細胞介導的炎癥，保護多巴胺神經(jīng)元，是治療帕金森病的潛在藥物。

5.5 對心血管的作用

Wei et al（2006）研究表明氯化兩面針堿能夠減少心肌缺血再灌注大鼠心肌酶的釋放，減輕氧自由基損傷程度，從而降低心肌缺血再灌注大鼠心律失常的發(fā)生率，推遲心律失常的發(fā)生時間，不僅縮短其持續(xù)時間，而且該作用呈一定的劑量依賴性。

5.6 其他

除上述的生理功能外，兩面針還在抗白血病、抗HIV、抗肝損傷等方面具有很好的活性。Liu et al（2015）發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿通過增加Thr58磷酸化水平加快c-Myc的降解，并下調c-Myc激活的miRNA，對K562細胞及原代CML細胞有殺傷作用。Wang et al（2015）發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿可調節(jié)HIV-1啟動子的表達和穩(wěn)定G-四鏈體，當加入氯化兩面針堿時G-四鏈體的Tm值范圍為56.6～63.2 ℃，為抗HIV-1藥物開發(fā)提供了新方法。

龐輝等（2006）研究了兩面針提取物對四氯化碳肝損傷的保護作用，結果表明兩面針提取物能明顯降低動物模型血清中谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和肝勻漿丙二醛（MDA）的含量，提高肝臟超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并顯示出一定的劑量依賴性，說明兩面針對化學性肝損傷具有明顯的保護作用。

6 展望

兩面針堿的抗菌、抗炎和抗腫瘤性能良好，具有極好的開發(fā)潛能，應用前景廣闊。但是，其在天然植物中的含量少，提取分離得率較低，不能滿足研究與規(guī)模生產(chǎn)的需要。因此，人工合成仍然是最優(yōu)先考慮的手段。

許多學者從不同的反應路徑出發(fā)實現(xiàn)了兩面針堿的全合成，但由于受到全合成路線或起始原料多樣性的影響，幾乎沒有兩面針堿結構衍生物的合成報道，特別是特定位點的取代衍生物。關于兩面針堿的化學結構，如氧原子、取代基的位置、種類與位阻、亞甲基以及其他結構與活性之間的構效關系如何尚不清楚，極大地限制了這一化合物的發(fā)展。因此，開發(fā)新型化學反應，優(yōu)化合成路線，經(jīng)濟高效地合成目標產(chǎn)物和結構衍生物，并在此基礎上系統(tǒng)地研究構效關系應是未來研究的重點之一。此外，氯化兩面針堿作為一類苯并菲啶生物堿，可能存在體外試驗活性很高，但由于代謝途徑或穩(wěn)定性的原因，體內試驗的結果可能并不理想，這就需要研究者在設計衍生結構時不僅要考察活性的提高，而且更要充分地考慮穩(wěn)定性，提高生物利用度。

目前，兩面針堿的抗腫瘤機制爭議較大，存在多種理論，這方面的研究有待進一步加強。研究兩面針堿化合物及其衍生物的抗腫瘤機制，能夠更加清晰地闡述各活性衍生物對腫瘤細胞的影響，確證兩面針堿衍生物的抗腫瘤物質基礎，這對構效關系的闡述極為重要，可以進一步指導結構的改造以篩選出活性更好、類藥性更高的先導化合物，為開發(fā)創(chuàng)新型藥物奠定基礎。

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