彭孟凡 范斌 張慶華 宋增福

摘要：【目的】獲得群體感應(yīng)（QS）信號分子降解能力更強(qiáng)的突變短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），增強(qiáng)其在水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治中的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)利用細(xì)菌QS淬滅機(jī)制防治細(xì)菌性疾病提供借鑒?！痉椒ā恳跃哂薪到釷S信號分子特性的短小芽孢桿菌F3-1為出發(fā)菌株、紫外線和亞硝酸鈉（NaNO2）為誘變劑進(jìn)行誘變選育；以紫色桿菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）為報告菌株篩選正向突變，經(jīng)連續(xù)傳代25代后測定其遺傳穩(wěn)定性；采用單因素試驗測定培養(yǎng)時間、pH、鹽度和溫度對突變菌株降解QS信號分子能力的影響，同時通過擴(kuò)增QS抑制基因aiiA及SDS-PAGE分析驗證突變菌株的蛋白表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】兩種誘變方法共獲得205株突變菌株，以紫色桿菌為報告菌株通過紫外誘變篩選出具有QS抑制作用的正向突變株4株，編號分別為FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。其中，突變菌株FF1-2的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1的3.12倍，對紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力較出發(fā)菌株F3-1提高64%，說明該突變菌株具有很強(qiáng)的QS抑制能力；連續(xù)傳代25代后，突變菌株FF1-2的產(chǎn)蛋白能力及對紫色素的抑制作用無顯著變化（P>0.05）。突變菌株FF1-2在培養(yǎng)時間為40 h、溫度30 ℃、鹽度0.5%、pH 7.0時，紫色素褪色效果最佳。從出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2中均能擴(kuò)增獲得753 bp的aiiA基因，且通過SDS-PAGE分析驗證二者在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶?！窘Y(jié)論】采用誘變育種技術(shù)篩選得到的突變菌株FF1-2能顯著提高QS抑制能力，且該抑制能力能穩(wěn)定遺傳，即通過誘變育種技術(shù)提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)酶量及酶活力具有可行性。

關(guān)鍵詞： 短小芽孢桿菌；群體感應(yīng)（QS）；誘變育種；aiiA基因；紫色桿菌

中圖分類號： S942.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）07-1423-09

0 引言

【研究意義】抗生素能大幅度降低水產(chǎn)細(xì)菌性疾病的死亡率，但過度使用易導(dǎo)致抗性病原菌形成及病原菌耐藥性、多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重（王瑞旋，2007；Verner-Jeffreys et al.，2009）。因此，探索新的細(xì)菌性病害防治手段勢在必行。群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是指細(xì)菌自身釋放一些小分子化合物，當(dāng)這些化合物累積到某個閾值時能與特定的受體蛋白結(jié)合，開啟相關(guān)基因的表達(dá)（Tang and Zhang，2014）。目前已知大多數(shù)革蘭氏陰性致病菌存在以N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）為信號分子的QS系統(tǒng)（Koul and Kalia，2017），許多毒力因子的表達(dá)均受其直接或間接調(diào)控（Surette et al.，1999）。淬滅QS信號分子的作用靶點與傳統(tǒng)抗生素完全不同，僅通過阻斷信號分子而抑制病原的致病能力，不影響細(xì)菌生長，從而避免耐藥突變株的出現(xiàn)（Koul et al.，2016）。因此，通過抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)降低病原菌致病力的策略，為水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治提供了新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，主要是通過QS淬滅酶降解信號分子，如aiiA基因編碼的AiiA蛋白是一類由芽孢桿菌產(chǎn)生的?；呓z氨酸內(nèi)酯酶，能專一性降解AHLs信號分子而破壞依賴QS的致病機(jī)制，降低病原菌的致病性。Dong等于2000年在蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）中首次發(fā)現(xiàn)具有群體感應(yīng)降解作用的AiiA酶，并證實其具有降解QS信號分子的作用。此后，在多種芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)AiiA酶（Dong et al.，2002；Pan et al.，2008；曾世涌等，2013；Vinoj et al.，2014），且研究證實通過生物工程技術(shù)手段表達(dá)AiiA酶在動植物病原菌防控方面發(fā)揮了重要作用（楊梅等，2007；Chen et al.，2010）。盡管通過基因工程可獲得較高產(chǎn)量的AiiA酶，但也存在表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)不穩(wěn)定的問題。Chen等（2010）用畢赤酵母成功表達(dá)獲得AiiA酶，但使用同樣分泌型表達(dá)載體，在婁瑞娟等（2010）的研究中并未完全表達(dá)出來，其原因可能是酵母表達(dá)系統(tǒng)本身的缺陷及重組mRNA中有非編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄阻斷而導(dǎo)致某些蛋白表達(dá)不理想。利用基因克隆技術(shù)能實現(xiàn)降解酶基因在大腸桿菌或畢赤酵母中表達(dá)，并提高降解酶的產(chǎn)量和活性，但得到的菌株缺乏穩(wěn)定性且功能單一，不具備芽孢桿菌的益生作用，加上生產(chǎn)成本偏高，而不利于大規(guī)模生產(chǎn)（黃志立等，2001）。誘變育種是非特異性改變菌株特性的一種簡便方法，雖然不能像基因工程技術(shù)一樣對菌株進(jìn)行定向定點突變，但可通過反復(fù)誘變及后期特異性篩選獲得目的突變菌株，目前已在菌株性能改良中廣泛應(yīng)用。呂志偉等（2011）通過紫外誘變地衣芽孢桿菌LCB-8得到突變菌株DY-97，其酶活力提高了17%；余祖華等（2016）利用該方法對產(chǎn)纖維素酶地衣芽孢桿菌進(jìn)行紫外線誘導(dǎo)，并成功獲得其突變菌株；吳勇等（2017）以紫外誘變枯草芽孢桿菌BS303，結(jié)果獲得常溫和低溫條件下對枯萎病均有很強(qiáng)拮抗能力且能顯著降低土壤病原菌數(shù)量的菌株。【本研究切入點】利用紫外誘變技術(shù)提高菌株的產(chǎn)酶量及酶活力已在地芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中得到廣泛應(yīng)用，但針對短小芽孢桿菌（B. pumilus）的研究很少，尤其利用該技術(shù)將芽孢桿菌應(yīng)用于群體感應(yīng)抑制作用方面的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從誘變育種技術(shù)角度入手，通過對前期從鯽魚腸道分離獲得且具QS抑制作用的短小芽孢桿菌F3-1（宋增福等，2013）進(jìn)行誘變選育，以期獲得QS信號分子降解能力更強(qiáng)的突變菌株，增強(qiáng)其在水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治中的效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)利用細(xì)菌QS淬滅機(jī)制防治細(xì)菌性疾病提供借鑒。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試菌株：短小芽孢桿菌F3-1由本課題組分離保存提供；紫色桿菌（Chromobacteria violaceum ATCC12472）購自美國ATCC公司。主要試劑：亞硝酸鈉（NaNO2），二甲基亞砜（DMSO），乙酸乙酯（C4H8O2），甲醇（CH3OH），硫酸銨[（NH4）2SO4]，0.1 mmol/L HCl和0.1 mmol/L NaOH，PCR Master Mix。供試培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2）、LB液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4）。主要儀器設(shè)備：超凈工作臺（SW-CJ-IF，蘇州凈化設(shè)備有限公司），高壓滅菌器（YXQ-LS-18SI，上海博訊實業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（SPX-100B-Z，上海博訊實業(yè)有限公司），離心機(jī)（TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器有限公司），分光光度計（722型，上海精密儀器儀表有限公司），凝膠成像儀[GEL DOC XR，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]，小垂直板電泳槽。

1. 2 菌株F3-1誘變育種

1. 2. 1 菌株F3-1生長曲線測定 將活化菌株F3-1以1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下?lián)u床（160 r/min）培養(yǎng)。每2 h測定一次OD600 nm，并繪制短小芽孢桿菌生長曲線。

1. 2. 2 誘變育種及突變菌株篩選 紫外誘變參照夏錢華等（2017）的方法：將1.7×108 CFU/mL的F3-1菌懸液涂布于LB培養(yǎng)基上，于15 W紫外燈下（距離30 cm）分別照射5、10、15、20和25 min后，28 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌水梯度稀釋后重新涂布于LB培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)。亞硝酸鈉（NaNO2）誘變參照Wu等（2013）的方法：接種1.7×108 CFU/mL的F3-1菌懸液于LB液體培養(yǎng)基中，分別加入終濃度為5、10、15、20和25 g/L的NaNO2溶液，28 ℃培養(yǎng)24 h后涂布于LB培養(yǎng)基上，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。

突變菌株篩選：以紫色桿菌ATCC12472為報告菌株，將誘變菌株轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心10 min后過0.22 μm濾膜，收集濾液；吸取濾液滴到濾紙片上，吹干后反扣于涂布有紫色桿菌的LB培養(yǎng)基上，26 ℃倒置培養(yǎng)48 h，依據(jù)能否使紫色桿菌紫色素褪去確定陽性突變菌株，并根據(jù)褪色圈確定突變效果（Chenia，2013）。

1. 2. 3 突變菌株粗提物對紫色桿菌生長的影響 粗提物制備參照肖支葉等（2017）的方法：突變菌株于28 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)6～10 h，超聲破碎后用乙酸乙酯萃取，充分振蕩后靜置過夜，8000 r/min離心20 min，取上層有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃）濃縮至干，干燥物用甲醇溶解至100 g/L。稀釋紫色桿菌菌液至OD600 nm=0.05，每組試管中加入突變菌株粗提物至終濃度100 mg/L，26 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)，以不加粗提物為對照組。每2 h測定一次OD600 nm，檢測突變菌株粗提物對紫色桿菌生長的影響。

1. 2. 4 突變菌株粗提物對紫色桿菌紫色素產(chǎn)量的影響 稀釋紫色桿菌菌液至OD600 nm=0.05，每組分別加入終濃度100 mg/L的突變菌株粗提物，26 ℃下?lián)u床（120 r/min）培養(yǎng)16 h后測定紫色素含量。紫色素提取參照許嫚（2015）的方法：突變菌株粗提物與紫色桿菌的混合液經(jīng)12000 r/min離心10 min后，加入DMSO并充分渦旋振蕩，再次離心后收集上清液于585 nm波長處測定OD。

1. 2. 5 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測定 將誘變后QS抑制效果最強(qiáng)的菌株接種于LB培養(yǎng)基連續(xù)傳代25代，利用濾紙片法（同1.2.2）每傳代5代測定其褪色直徑，同時測定蛋白產(chǎn)量及紫色素的OD585 nm，評價菌株的遺傳穩(wěn)定性。其中，胞外蛋白粗提參照余祖華等（2016）的方法：過夜培養(yǎng)的菌液在4 ℃下10000 r/min離心15 min，過0.22 μm濾膜，加入固體硫酸銨至80%飽和度，4 ℃靜置過夜后再次離心，以PBS溶解沉淀，即為蛋白粗提液；然后采用Bradford法測定菌株蛋白產(chǎn)量。

1. 3 不同環(huán)境下突變菌株對紫色素的抑制能力

1. 3. 1 培養(yǎng)時間 將出發(fā)菌株（F3-1）和突變菌株的粗提物分別加入已接種紫色桿菌的LB培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣一次，參照1.2.5的方法提取紫色素并測定OD585 nm。

1. 3. 2 pH 用0.1 mmol/L HCl或0.1 mmol/L NaOH調(diào)節(jié)出發(fā)菌株和突變菌株粗提物的pH分別為3.0、5.0、7.0、9.0和11.0，作用1 h后將pH調(diào)至7.0，測定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 3 鹽度 用氯化鈉配制鹽度0.5%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%的培養(yǎng)基，將出發(fā)菌株和突變菌株分別接種于上述培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，測定OD585 nm，方法同1.2.5。

1. 3. 4 溫度 按照1.2.5的方法制備粗提物后，分別在20 ℃處理24 h、30 ℃處理24 h、40 ℃處理12 h、50 ℃處理1 h和60 ℃處理30 min后加入已接種紫色桿菌的培養(yǎng)基，測定OD585 nm。

1. 4 QS抑制基因aiiA檢測

根據(jù)NCBI已公布的aiiA基因序列（EF219409），利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物。引物序列為：F（5'-ATGGGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTAT-3'）和R（5'-GTCGAATTCCTCAACAAGATACTCCTAA

TG-3'）。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Master Mix 25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1. 5 突變菌株蛋白粗提液SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE分析出發(fā)菌株和突變菌株的粗蛋白提取液，方法同1.2.5，并進(jìn)行凝膠分析儀成像分析。

1. 6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析，并以Turkey進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 短小芽孢桿菌F3-1的生長曲線

菌株F3-1的生長曲線如圖1所示。經(jīng)過一段時間的延遲期后，菌株F3-1從第8 h進(jìn)入對數(shù)生長期，其后菌體生長迅速，菌體濃度快速升高；穩(wěn)定期在培養(yǎng)24～40 h。根據(jù)菌株F3-1的生長曲線選取培養(yǎng)20 h的菌體進(jìn)行誘變處理。

2. 2 突變菌株篩選結(jié)果

兩種誘變方法共獲得205株突變菌株，其中以紫色桿菌ATCC12472為報告菌株通過紫外誘變篩選出具有QS抑制作用的正向突變菌株4株，編號分別為FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1。由表1可知，與出發(fā)菌株F3-1相比，4株突變菌株的QS抑制能力均明顯提高。其中，突變菌株FF1-2經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1（15.2 μg/mL）的3.12倍，二者差異顯著（P<0.05，下同），對紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株的2.96倍（圖2），即突變菌株FF1-2的誘變效果最佳。

2. 3 突變菌株粗提物對紫色桿菌生長的影響

突變菌株粗提物對紫色桿菌生長的影響如圖3所示。將出發(fā)菌株F3-1及突變菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-2的粗提物分別加入含紫色桿菌菌液的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)紫色桿菌的生長趨勢與對照組一致，無顯著影響（P>0.05，下同）。

2. 4 突變株粗提物對紫色桿菌產(chǎn)紫色素的影響

4株突變菌株粗提物對紫色桿菌產(chǎn)紫色素有明顯影響（圖4）。其中，突變菌株FF1-2的OD585 nm顯著低于出發(fā)菌株F3-1，抑制紫色素的能力最強(qiáng)（圖5）。紫色素抑制率（%）=（1-A1/A0）×100。式中，A0為出發(fā)菌株F3-1的OD585 nm，A1為突變菌株的OD585 nm。根據(jù)該公式計算得出，突變菌株FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1對紫色桿菌紫色素的抑制率分別為64%、42%、33%和47%。

2. 5 突變株轉(zhuǎn)接穩(wěn)定性檢測結(jié)果

對QS抑制作用最強(qiáng)的突變菌株FF1-2連續(xù)傳代25代，每隔5代測定其蛋白含量、對紫色桿菌的褪色直徑及對紫色素的抑制能力。結(jié)果顯示，突變菌株FF1-2在連續(xù)傳代25代后，對紫色桿菌的褪色能力無明顯變化（圖6）。由圖7可知，傳代25代后突變菌株FF1-2對紫色桿菌的褪色直徑仍穩(wěn)定在3.7 cm，蛋白產(chǎn)量穩(wěn)定在46.7±1.58 μg/mL，對紫色素的降解能力差異不顯著，說明該突變菌株的突變特性遺傳穩(wěn)定。

2. 6 不同培養(yǎng)條件下突變菌株FF1-2對紫色素的抑制能力

2. 6. 1 培養(yǎng)時間 隨培養(yǎng)時間的延長，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對紫色素的抑制作用均呈先升高后降低的變化趨勢，在培養(yǎng)24～48 h的抑制作用最佳。出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2均在培養(yǎng)至40 h時對紫色素的抑制作用最強(qiáng)，且突變菌株FF1-2對紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍（圖8）。

2. 6. 2 pH 在pH 3.0～11.0的范圍內(nèi)，出發(fā)菌株F3-1抑制紫色素的能力受pH變化影響較突變菌株FF1-2的小，二者對紫色素的抑制能力均呈先升高后降低的變化趨勢，且在pH 7.0時的抑制能力最強(qiáng)，突變菌株FF1-2對紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的2.50倍（圖9）。

2. 6. 3 鹽度 鹽度對出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2抑制紫色素能力的影響見圖10。當(dāng)鹽度由0.5%升至4.0%時，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對紫色素的抑制能力降低，當(dāng)鹽度超過6.0%后曲線趨于平穩(wěn)。因此，可確定鹽度為0.5%時的抑制能力最強(qiáng)，鹽度升高則不利于出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對紫色素的抑制作用。

2. 6. 4 溫度 經(jīng)出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2作用后的紫色桿菌，其紫色素含量在20～30 ℃呈下降趨勢，至30 ℃時OD585 nm達(dá)最低值，之后呈上升趨勢。說明30 ℃為最適合降解紫色素的溫度，且突變菌株FF1-2在30 ℃下對紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍（圖11）。

2. 7 QS抑制基因aiiA的克隆結(jié)果

根據(jù)NCBI已公布的aiiA基因序列設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.7%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2均在750 bp附近出現(xiàn)明顯條帶（圖12），測序結(jié)果表明其基因片段大小與Dong等（2000）的研究報道一致，即兩株菌株的基因序列中均含有753 bp的目的基因片段。

2. 8 誘變前后菌株胞外蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

短小芽孢桿菌F3-1誘變前后胞外蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果見圖13。出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶，其分子量與Easwaran等（2015）的研究報道一致，且突變菌株FF1-2的蛋白表達(dá)量明顯高于出發(fā)菌株F3-1。

3 討論

誘變育種是微生物的常規(guī)育種技術(shù)，是以化學(xué)或物理手段誘發(fā)基因突變，通過篩選突變體，定向?qū)ふ艺蛲蛔兊囊豁椉夹g(shù)。該方法突變率高，在短時間內(nèi)可獲得大量的優(yōu)良變異類型，且誘變手段多樣，操作簡便，是實驗室研究及工業(yè)生產(chǎn)中最常用的優(yōu)良菌株選育方法（范俊英等，2012；艾冰花等，2015；白豆等，2016）。同時，芽孢桿菌是目前水產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的益生菌，具有易生產(chǎn)、便運輸、耐儲藏等特點，在調(diào)節(jié)水質(zhì)、增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力、減少病害發(fā)生等方面效果顯著，是常用的益生微生物菌株（Hong et al.，2005）。本研究以前期篩選出的一株具有QS信號分子降解能力的短小芽孢桿菌F3-1（宋增福等，2013）為出發(fā)菌株，通過紫外誘變獲得4株突變菌株（FF1-2、FF3-2、FF3-3和FF4-1），其中，突變菌株FF1-2的蛋白產(chǎn)量達(dá)47.48±2.87 μg/mL，約是出發(fā)菌株F3-1的3.12倍，對紫色桿菌的褪色圈直徑是出發(fā)菌株F3-1的2.96倍，抑制紫色素的能力較出發(fā)菌株F3-1提高64%，說明紫外誘變獲得的突變菌株FF1-2具有很強(qiáng)的QS抑制能力；連續(xù)傳代25代后，突變菌株FF1-2的產(chǎn)蛋白能力及對紫色素的抑制作用無明顯變化，說明該突變菌株的突變特性遺傳穩(wěn)定，為解決利用分子生物學(xué)技術(shù)中因質(zhì)粒穩(wěn)定性差等而導(dǎo)致基因工程菌不穩(wěn)定的問題提供了參考。此外，從出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2中均能擴(kuò)增獲得753 bp的aiiA基因，且通過SDS-PAGE分析驗證二者在28 kD處均呈現(xiàn)出特異條帶，但突變菌株FF1-2的蛋白表達(dá)量明顯高于出發(fā)菌株F3-1。根據(jù)Easwaran等（2015）、Vinoj等（2015）的研究結(jié)果（QS信號分子降解酶AiiA的分子量為28 kD），可初步推測兩株菌株的QS抑制作用蛋白可能為AiiA同源酶。

短小芽孢桿菌與其他微生物一樣，其產(chǎn)酶活性與培養(yǎng)溫度、時間、pH及鹽度等條件密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，突變菌株FF1-2的最佳抑制紫色素時間為40 h，對紫色素的抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的3.00倍，在培養(yǎng)24～48 h內(nèi)抑制能力較強(qiáng)，培養(yǎng)時間超過40 h后抑制能力逐漸下降。這可能是培養(yǎng)24～48 h的菌株已處于對數(shù)生長期，菌株生長達(dá)到一定濃度，產(chǎn)酶量不斷積累，QS抑制能力強(qiáng)，但培養(yǎng)48 h進(jìn)入衰退期后菌株產(chǎn)蛋白能力有所下降，對紫色素的抑制作用也隨之變?nèi)酰煌蛔兙闒F1-2在pH 7.0～9.0時對紫色素的抑制能力最強(qiáng)，其抑制能力約是出發(fā)菌株F3-1的2.50倍；最適溫度為30 ℃，超過50 ℃后菌株誘變前后對紫色素的抑制能力基本一致。此外，出發(fā)菌株F3-1和突變菌株FF1-2對紫色素抑制的最適鹽度均在0.5%左右，超過6.0%的鹽度對菌株抑制紫色素的影響不明顯，對鹽度的適應(yīng)能力高于張美超等（2011）在畢赤酵母菌中克隆表達(dá)的AiiA-AIO6酶工程菌?？傊?，突變菌株FF1-2對紫色素抑制能力的理化因素與AHLs活性的最適條件相統(tǒng)一，可進(jìn)一步推測SDS-PAGE分析中28 kD處的蛋白條帶即為AiiA同源蛋白。

本研究首次通過誘變育種技術(shù)篩選出能穩(wěn)定遺傳且對QS信號分子高效敏感的短小芽孢桿菌突變菌株FF1-2，與基因克隆方法相比，誘變育種手段多樣，操作簡便，能豐富和拓寬菌種的變異類型，尤其是自然界少有的性狀變異，增加可利用的基因資源。以此為基礎(chǔ)，利用分子克隆手段查找變異位點，確定誘變育種菌株的QS分子機(jī)制，可為突變菌株FF1-2的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用誘變育種技術(shù)篩選得到的突變菌株FF1-2能顯著提高QS抑制能力，且該抑制能力能穩(wěn)定遺傳，即通過誘變育種技術(shù)提高短小芽孢桿菌的產(chǎn)酶量及酶活力具有可行性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）