李瑞雪 王鈺婷 胡飛 夏家鳳 汪泰初 趙衛(wèi)國

摘要：【目的】建立桑樹的病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）轉(zhuǎn)化體系，為桑樹功能基因的分析研究提供技術(shù)支持。【方法】以豐馳桑為試驗(yàn)材料，克隆含BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)的八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因片段，經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切后與煙草脆裂病毒（TRV）連接構(gòu)建重組病毒載體pTRV2-PDS，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后通過壓迫注射方式侵染桑樹幼苗葉片?！窘Y(jié)果】克隆獲得的桑樹PDS基因干擾片段346 bp，與改造后的TRV質(zhì)粒連接可成功構(gòu)建攜帶桑樹PDS基因的重組病毒載體pTRV2-PDS。桑樹葉片被侵染15 d后，接種重組病毒載體pTRV2-PDS桑樹的第二輪真葉開始出現(xiàn)葉片白化現(xiàn)象，侵染20 d后，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周逐漸擴(kuò)散，葉片呈現(xiàn)明顯的白化表型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，重組病毒載體pTRV2-PDS侵染的桑葉PDS基因相對(duì)表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照（pTRV2）的58%，二者差異極顯著（P<0.01），表明桑樹PDS基因表達(dá)被有效抑制?！窘Y(jié)論】利用TRV構(gòu)建的桑樹VIGS體系能有效沉默PDS基因，使桑樹葉片呈現(xiàn)明顯的白化癥狀，即可用于后續(xù)的桑樹功能基因鑒定。

關(guān)鍵詞： 桑樹；八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）；病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）；煙草脆裂病毒（TRV）；白化表型

中圖分類號(hào)： S888.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）07-1432-07

0 引言

【研究意義】病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）是近年發(fā)展起來的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）現(xiàn)象，是植物抵抗病毒侵染的一種自然機(jī)制（Shao et al.，2008），被開發(fā)成一種高效、快速研究植物功能基因的反向遺傳學(xué)新技術(shù)（牛義嶺等，2016），目前已構(gòu)建了以DNA病毒、RNA病毒、DNA衛(wèi)星分子和衛(wèi)星病毒為載體的VIGS體系（Geuten et al.，2013；王旭等，2016）。與基因敲除、轉(zhuǎn)基因、突變體篩選等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，VIGS無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株，具有周期短、操作簡(jiǎn)便、獲得表型快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物抗病、逆境脅迫、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長發(fā)育等相關(guān)基因功能研究（Zhou and Huang，2012；Kandoth et al.，2013；Pflieger et al.，2013），在植物功能基因組學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Kumagai等（1995）將一段八氫番茄紅素脫氫酶（Phytoene desaturase，PDS）的cDNA插入煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）基因組上，首次構(gòu)建了VIGS轉(zhuǎn)化載體并將煙草中的PDS基因成功沉默。PDS是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，常作為評(píng)價(jià)VIGS是否成功的參照基因（Bennypaul et al.，2012）。在以類胡蘿卜素為主要色素的植物中，類胡蘿卜素具有光保護(hù)作用，若PDS基因被成功沉默，植株幼嫩葉片將呈現(xiàn)出白化癥狀，表型變化明顯，易于觀察辨別（Sun et al.，1998）。Ruiz等（1998）將一段PDS基因cDNA插入馬鈴薯X病毒（Potato X virus，PVX）基因組上，通過根癌農(nóng)桿菌將重組病毒侵染馬鈴薯，其葉片呈失去光保護(hù)作用的白化效應(yīng)，因此提出利用PVX通過VIGS可有效沉默植物內(nèi)源基因，進(jìn)而鑒定出未知基因的生物學(xué)功能。Kjemtrup等（1998）利用番茄金色花葉病毒（Tomato golden mosaic virus，TGMV）構(gòu)建了以DNA病毒誘導(dǎo)的VIGS體系，并以TGMV DNA-A和TGMV DNA-B構(gòu)建重組病毒載體，成功沉默鎂離子螯合酶的關(guān)鍵基因Sulfur和luc熒光蛋白基因。Ratcliff等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，利用煙草脆裂病毒（Tobacco ra-ttle virus，TRV）構(gòu)建VIGS轉(zhuǎn)化體系的重組病毒載體，誘導(dǎo)功能基因沉默的效率和持久性均優(yōu)于PVX載體，同時(shí)TRV本身對(duì)受體植物產(chǎn)生的不利癥狀也輕于PVX。目前VIGS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水稻（Kant et al.，2015）、煙草（Li and Yoshikawa，2015）、小麥（Buhrow et al.，2016）、馬鈴薯（Dobnik et al.，2016）、番茄（Li et al.，2016）和擬南芥（Bilichak and Kovalchuk，2017）等作物上，在刺萼龍葵（Meng et al.，2016）、棉花（Mustafa et al.，2016）和菠菜（Lee et al.，2017）等植物上也有成功報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】林木植物因生長周期長、遺傳轉(zhuǎn)化難度大，且不易獲得轉(zhuǎn)基因植株，致使其功能基因研究進(jìn)展緩慢，而VIGS技術(shù)有望突破這一技術(shù)瓶頸，極大促進(jìn)林木植物基因功能的分析鑒定。蘋果、柑橘等植物VIGS體系構(gòu)建已獲得突破，能高效誘導(dǎo)相關(guān)功能基因的沉默（Sasaki et al.，2011；Agüero et al.，2012），但在桑樹方面至今未見有關(guān)VIGS技術(shù)的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建攜帶桑樹PDS基因片段的VIGS重組載體，并通過農(nóng)桿菌侵染桑樹，建立桑樹VIGS轉(zhuǎn)化體系，為桑樹功能基因的分析研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試桑樹品種為豐馳桑，其種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存提供；用于建立VIGS體系的TRV載體（pTRV1和pTRV2）購自蘇州凱益生物科技有限公司；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101自帶pMP90質(zhì)粒，具有慶大霉素、利福平和卡那霉素抗性，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所桑樹遺傳實(shí)驗(yàn)室保存提供；FastStart Universal SYBR Green Master Mix Kit購自Roche公司，RNAiso Plus、M-MLV（RNaseH-）、Oligo（dT）12～18 Primer、Ex Taq DNA Polymerase、Mini Best Plasmid Purification Kit、DNA Ligation Kit、pMD20-T載體和DNA Marker等購自TaKaRa公司。

1. 2 桑樹幼苗培養(yǎng)

豐馳桑種子在無菌水中浸泡1～2 d（4 ℃），然后將浸泡好的桑樹種子撒在裝有營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石=4∶1）的塑料盆土層表面，澆透水并覆蓋薄層營養(yǎng)土，做好標(biāo)記，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件：光照周期為白天16 h+黑夜8 h，對(duì)應(yīng)溫度為25和22 ℃，空氣相對(duì)濕度80%。種子發(fā)芽后7～10 d，等兩片子葉完全展開后進(jìn)行侵染試驗(yàn)。

1. 3 總RNA提取及PDS基因干擾片段克隆

將桑樹嫩葉樣品放入經(jīng)液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速充分研磨至粉末狀，以RNAiso Plus充分混勻，再根據(jù)RNAiso Plus總RNA快速提取試劑盒說明提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度、純度及其完整性。調(diào)整各樣品總RNA濃度，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。對(duì)桑樹PDS基因（XM_010102809.1）、棗樹PDS基因（XM_016031629.1）和牛奶子PDS基因（GQ254067.1）進(jìn)行序列比對(duì)，選取三者同源性較高的片段，利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物PDS-F1/PDS-R1（表1），且在上、下游引物5'端分別添加BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），以cDNA為模板，進(jìn)行干擾片段擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，具體操作參照試劑盒說明。

1. 4 重組病毒載體pTRV2-PDS構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶BamH I和Xba I同時(shí)對(duì)PDS基因干擾片段擴(kuò)增產(chǎn)物和pTRV2進(jìn)行雙酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收處理后，用T4 DNA連接酶在16 ℃下連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定后提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1. 5 VIGS沉默體系建立

將重組病毒載體pTRV2-PDS、pTRV1和pTRV2（陰性對(duì)照）通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，在卡那霉素（50 mg/L）、慶大霉素（25 mg/L）和利福平（25 mg/L）的抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定呈陽性的克隆菌液即為GV3101-pTRV2-PDS根癌農(nóng)桿菌菌液和GV3101-pTRV2根癌農(nóng)桿菌菌液。將兩種菌液接種到含卡那霉素、慶大霉素和利福平抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng)。離心收集菌體，用重懸液[含10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-N嗎啉代乙磺酸（MES），150 μmol/L乙酰丁香酮（AS）]懸浮菌體，調(diào)整OD600=1.0左右。渦旋混勻后，室溫靜置3 h以上，準(zhǔn)備侵染。

取等體積的GV3101-pTRV1載體根癌農(nóng)桿菌重懸液與重組病毒載體GV3101-pTRV2-PDS根癌農(nóng)桿菌重懸液充分混合，進(jìn)行注射侵染。選擇生長狀況良好且長勢(shì)一致的桑苗，用一次性注射器針頭在桑苗子葉背面輕微摩擦制造傷口，然后使用去掉針頭的注射器在傷口處通過壓迫注射方式將含有重組病毒載體的根癌農(nóng)桿菌重懸液注入葉片中，每片葉約注入10 ?L，使菌液在葉片中擴(kuò)散。以注射GV3101-pTRV2農(nóng)桿菌菌液為陰性對(duì)照組，注射不含菌液的重懸液為空白對(duì)照組，每組10棵，3次重復(fù)。將注射感染后的植株在鐵盤中培養(yǎng)，澆足水，黑暗放置1 d后轉(zhuǎn)入16 h/8 h的光照/黑暗周期、25 ℃和80%濕度條件下培養(yǎng)，觀察桑樹葉片的表型變化。

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）鑒定

分別從pTRV2-PDS和pTRV2侵染的桑樹葉片中提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR對(duì)PDS基因的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行定量分析，所用定量引物見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系20.0 ?L：SYBR Green Master Mix 10.0 ?L，PCR Forward Primer（10 ?mol/L）1.0 ?L，PCR Reverse Primer（10 ?mol/L）1.0 ?L，12倍稀釋的cDNA模板3.0 ?L，ddH2O補(bǔ)足至20.0 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。然后按照FastStart Universal SYBR Green Master Mix Kit說明在LightCycler 96 well Real-Time PCR System上進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量RQ=2-ΔΔCt（姜上川等，2016）。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并以SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 桑樹PDS基因干擾片段的克隆及測(cè)序分析結(jié)果

以特異引物PDS-F1/PDS-R1擴(kuò)增含BamH I和Xba I酶切位點(diǎn)的桑樹PDS基因干擾片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在350 bp附近出現(xiàn)特異條帶，且條帶清晰單一（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。純化回收目的條帶并連接至pMD20-T載體上，重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示成功克隆獲得桑樹PDS基因干擾片段（346 bp），可用于構(gòu)建重組病毒載體。

2. 2 桑樹PDS基因VIGS重組載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

TRV屬于RNA病毒，具有兩條RNA鏈（RNA1和RNA2），改造后的病毒包括分別裝載RNA1和RNA2遺傳信息的兩個(gè)獨(dú)立質(zhì)粒結(jié)構(gòu)（pTRV1和pTRV2）。其中，pTRV1質(zhì)粒上的運(yùn)動(dòng)蛋白促進(jìn)病毒在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)；pTRV2質(zhì)粒則攜帶用于沉默目的基因的干擾片段。將擴(kuò)增獲得的桑樹PDS基因干擾片段連接至pMD20-T載體上，篩選陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，雙酶切作用下將其連接到pTRV2載體上，即構(gòu)建獲得桑樹重組病毒載體pTRV2-PDS。圖2為桑樹重組病毒載體pTRV2-PDS構(gòu)建流程，含有PDS基因干擾片段、CaMV35S啟動(dòng)子及病毒外殼蛋白CP。通過PCR鑒定和Sanger測(cè)序驗(yàn)證，將陽性重組病毒載體pTRV2-PDS通過凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增可得到346 bp的目的條帶（圖3）；經(jīng)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與桑樹PDS基因干擾片段的序列完全一致，說明已成功構(gòu)建桑樹重組病毒載體pTRV2-PDS。

2. 3 侵染接種及葉片白化表型顯現(xiàn)情況

以在光照培養(yǎng)箱中萌芽長出兩片子葉的桑樹幼苗為試驗(yàn)材料，通過壓迫注射方式將含重組病毒載體pTRV2-PDS的農(nóng)桿菌重懸液注入桑樹子葉中，葉片侵染后可觀察到明顯的圓形痕跡，葉面充滿液體。侵染15 d后，發(fā)現(xiàn)接種重組病毒載體pTRV2-PDS試驗(yàn)組桑苗的第二輪真葉開始出現(xiàn)葉片白化癥狀（圖4-A）；侵染20 d后，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周逐漸擴(kuò)散（圖4-B），說明沉默載體開始發(fā)揮作用，PDS基因被成功沉默；而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的桑樹子葉無任何變化，均未出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖4-C和圖4-D）。

2. 4 病毒外殼蛋白CP基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

采集空白對(duì)照組葉片、陰性對(duì)照組葉片、重組病毒載體pTRV2-PDS侵染組（PDS-VIGS）葉片，根據(jù)TRV的CP基因序列（Z36974.2）設(shè)計(jì)特異性引物（表1），分別進(jìn)行病毒CP基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅空白對(duì)照組的葉片未檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的目的條帶，陰性對(duì)照和重組病毒載體pTRV2-PDS侵染組的葉片均能檢測(cè)到預(yù)期的目的條帶（圖5），表明構(gòu)建的重組病毒載體pTRV2-PDS已在桑樹葉片中繁殖傳播。

2. 5 桑樹PDS基因的qRT-PCR定量分析結(jié)果

為進(jìn)一步檢測(cè)重組病毒載體pTRV2-PDS的沉默效果，采用qRT-PCR檢測(cè)桑樹PDS基因的相對(duì)表達(dá)情況。由圖6可看出，重組病毒載體pTRV2-PDS侵染組的PDS基因相對(duì)表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的58%，二者差異極顯著（P<0.01），表明桑樹PDS基因表達(dá)被有效抑制。綜合桑樹葉片白化表型，說明克隆獲得的桑樹PDS基因正確，且利用TRV構(gòu)建的桑樹VIGS體系能有效沉默目的基因，可用于后續(xù)的桑樹基因功能鑒定。

3 討論

至今，VIGS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物生長發(fā)育、器官形成、非生物脅迫、抗病蟲害、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝等生命進(jìn)程中的相關(guān)基因功能研究，在植物功能基因組學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用（Nelson et al.，2004）。桑樹等林木植物的基因組龐大、生長周期長、遺傳轉(zhuǎn)化效率低，且轉(zhuǎn)基因植株難以獲得，致使利用常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究桑樹基因功能的進(jìn)展緩慢。為此，本研究將VIGS技術(shù)應(yīng)用到桑樹上，旨在建立桑樹VIGS轉(zhuǎn)化體系，為桑樹功能基因的分析研究提供技術(shù)支持，進(jìn)而加快桑樹相關(guān)功能基因分析鑒定的進(jìn)程。PDS基因是類胡蘿卜素合成途徑的限速酶基因，主要在植物葉片、花朵和果實(shí)中表達(dá)，當(dāng)其合成受阻時(shí)植物會(huì)出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，表型肉眼易觀測(cè)。因此，構(gòu)建植物VIGS體系時(shí)一般將PDS基因作為報(bào)告基因。本研究中使用的TRV在多種植物中尤其是木本植物中均能成功構(gòu)建重組病毒載體，具有廣泛的適應(yīng)性，且基因沉默效率高、持續(xù)時(shí)間長、病毒癥狀較輕（Huang et al.，2012），在一些植物中還可通過種子將沉默的表型遺傳給后代，其沉默表型甚至可維持兩年（Senthil-Kumar and Mysore，2011）。本研究結(jié)果表明，桑樹葉片被侵染15 d后，接種重組病毒載體pTRV2-PDS試驗(yàn)組桑樹的第二輪真葉開始呈現(xiàn)葉片白化癥狀，侵染20 d后，白化現(xiàn)象沿葉脈向四周逐漸擴(kuò)散，說明沉默載體已開始發(fā)揮作用。

目的基因的沉默效率可通過半定量PCR、qRT-PCR及Northern blotting等分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，無論采用何種檢測(cè)方法，都是將植物內(nèi)源性表達(dá)的mRNA作為檢測(cè)對(duì)象，故引物序列應(yīng)設(shè)計(jì)在插入干擾片段以外的目的基因區(qū)域，以避免病毒載體攜帶干擾片段擴(kuò)增時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾（Spitzer-Rimon et al.，2013）。利用qRT-PCR可快速、定量檢測(cè)目的基因的沉默情況，且靈敏度高，但也有研究報(bào)道指出qRT-PCR的檢測(cè)片段一般在100 bp左右，而沉默過程可能恰好降解產(chǎn)生此類片段，即使將引物序列設(shè)計(jì)在插入干擾片段以外，其檢測(cè)結(jié)果也不理想（Geuten et al.，2013）。為避免這一問題，本研究在設(shè)計(jì)qRT-PCR引物時(shí)選擇將擴(kuò)增片段設(shè)為同時(shí)覆蓋插入干擾片段和插入干擾片段以外的PDS基因區(qū)域，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，重組病毒載體pTRV2-PDS侵染組的PDS基因相對(duì)表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的58%，二者差異極顯著，表明桑樹PDS基因表達(dá)被有效抑制。綜合桑樹葉片白化表型，說明克隆獲得的桑樹PDS基因正確，且利用TRV構(gòu)建的桑樹VIGS體系能有效沉默目的基因，可用于后續(xù)的桑樹功能基因鑒定。

4 結(jié)論

利用TRV構(gòu)建的桑樹VIGS體系能有效沉默PDS基因，使桑樹葉片呈現(xiàn)明顯的白化癥狀，即可用于后續(xù)的桑樹功能基因鑒定。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）