佟延南 李芳遠(yuǎn) 李忠琴 趙光軍 李高俊 王德強(qiáng)

摘要：【目的】動(dòng)態(tài)分析不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的多樣性，為科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改良提供理論依據(jù)。【方法】分別于羅非魚養(yǎng)殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）采集羅非魚腸道樣品，以試劑盒提取腸道總細(xì)菌DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后對16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行高通量測序，并對腸道微生物進(jìn)行物種組成差異分析?！窘Y(jié)果】各樣品測序中Tag數(shù)量平均為60694條，測序長度平均為440 bp，OTU Shannon稀釋曲線趨于平緩并達(dá)到平臺(tái)期；平均OTU數(shù)量排序?yàn)镃2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667），chao1、ACE、Shannon和npShannon指數(shù)也表現(xiàn)出相同規(guī)律，但Simpson指數(shù)的排序?yàn)镃2期（0.0405716）C3期>C1期。在各養(yǎng)殖階段微生物種群數(shù)量占2.00%以上有11個(gè)門和14個(gè)屬，優(yōu)勢菌群有所差異，隨養(yǎng)殖周期的推移，乳球菌屬所占比例逐漸下降，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬呈先增后減的變化趨勢，梭菌屬和鄰單胞菌屬在養(yǎng)殖前期所占比例最高。此外，不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標(biāo)記類群存在一定差異，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高?！窘Y(jié)論】不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標(biāo)記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

關(guān)鍵詞： 羅非魚；腸道微生物；群落結(jié)構(gòu)；多樣性；高通量測序

中圖分類號(hào)： S965.125 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）07-1415-08

0 引言

【研究意義】魚類腸道微生物存在于腸道壁、腸道黏膜及其內(nèi)容物中（Cheesman and Guillemin，2007；Dethlefsen et al.，2007），是魚類腸道的重要組成部分（宋增福和吳天星，2007；呂欣榮和肖克宇，2008），在維持機(jī)體代謝、發(fā)育及進(jìn)化等方面發(fā)揮重要作用（趙明曉和賀永亮，2008；Bosch and McFall-Ngai，2011；Goodman and Gordon，2010）。魚類腸道微生物處于特殊的腸道環(huán)境和水體環(huán)境中，極易受食物和環(huán)境等因素變化的影響，魚體自身的生長也會(huì)影響其腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)（Spanggaard et al.，2000；Savas et al.，2005）。因此，研究分析魚類腸道微生物的多樣性，對篩選益生菌或調(diào)控其養(yǎng)殖環(huán)境等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，研究魚類腸道微生物群落的傳統(tǒng)方法是將微生物純化后再進(jìn)行培養(yǎng)（覃映雪等，2007；胡秀彩等，2010），該方法可對腸道微生物的形態(tài)、性質(zhì)及其群落結(jié)構(gòu)等進(jìn)行常規(guī)分析，但在菌落形態(tài)和顏色變化等方面易存在主觀性判斷（Maidie et al.，2003）。此外，有學(xué)者運(yùn)用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)繪制出草魚腸道菌群的指紋圖譜（郁二蒙等，2012），雖然該技術(shù)可較全面系統(tǒng)分析腸道菌群的生物多樣性，但在時(shí)效上仍不及高通量測序技術(shù)（秦楠等，2011）。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于PCR的分子生物學(xué)方法越來越多被應(yīng)用于腸道微生物研究（周孟姣和劉臻，2003；趙翔和安志東，2003；凌云等，2010），極大提高了研究效率及分析的準(zhǔn)確性，為腸道微生物研究奠定了良好基礎(chǔ)（李鳳和劉世貴，2003；任南琪等，2007）。其中，高通量測序技術(shù)是目前基因組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，具有通量更高、運(yùn)行時(shí)間更短、測序片段更長、成本更低等優(yōu)點(diǎn)（孫嘉蔓等，2014；葉雷等，2016），能有效避免Sanger法的繁瑣克隆過程。王紹祥等（2014）通過高通量測序技術(shù)研究了魚類養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落特征；許燕等（2018）采用Illumina HiSeq PE250高通量測序技術(shù)研究了斑石鯛腸道的細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，采用高通量測序技術(shù)分析養(yǎng)殖羅非魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于細(xì)菌16S rDNA高通量測序技術(shù)對海南省不同養(yǎng)殖地區(qū)整個(gè)養(yǎng)殖周期的羅非魚腸道微生物多樣性進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，為科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

分別于羅非魚養(yǎng)殖周期的前期（C1，4月）、中期（C2，6月）和后期（C3，8月）對海南三江（SJ）、文昌（WC）和屯昌（TC）的羅非魚養(yǎng)殖場進(jìn)行定點(diǎn)樣品采集，每個(gè)地點(diǎn)采集三口池塘作為生物學(xué)重復(fù)，樣品編號(hào)及其具體信息見表1。

1. 2 DNA提取及16S rDNA高通量測序

采用Sigma公司生產(chǎn)的Stool DNA Kit試劑盒提取羅非魚腸道內(nèi)容物總細(xì)菌DNA，并以1%瓊脂糖凝膠電泳和PCR進(jìn)行檢測。提取的DNA樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA高通量測序，測序區(qū)域?yàn)閂3～V4區(qū)，測序平臺(tái)為Illumina Miseq 2×250。

1. 3 測序結(jié)果分析

樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后拼接成Tag，并根據(jù)Tag進(jìn)行物種分類、OTU分析、多樣性分析和多樣品的比較分析等。利用Mothur對測序序列進(jìn)行去冗余處理，使用基于Naive Bayesian的分類器RDP Classifier工具對Tag進(jìn)行物種注釋。計(jì)算97%相似度下的OTU數(shù)量，并根據(jù)眾數(shù)原則對OTU進(jìn)行物種注釋。采用PICRUSt進(jìn)行OTU pathway注釋，以Mothur進(jìn)行樣品α多樣性分析；采用R軟件進(jìn)行熱圖分析、PCA分析、β多樣性分析和樣品聚類分析；并以LEfSe分析組間菌群差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的α多樣性差異分析結(jié)果

樣品測序結(jié)果經(jīng)去冗余處理后，各樣品中Tag數(shù)量在24267～87672條，平均為60694條，測序長度301～489 bp，平均為440 bp；OTU Shannon稀釋曲線趨于平緩并達(dá)到平臺(tái)期（圖1），說明測序量趨于飽和，高通量測序結(jié)果可較全面反映樣品中微生物組成。利用Mothur計(jì)算0.03距離下的OTU數(shù)量，再基于OTU計(jì)算樣品的α多樣性，結(jié)果（表2）表明，平均OTU數(shù)量排序?yàn)镃2期（9376.125）>C3期（8591.375）>C1期（6567.667）；此外，C2期的Shannon和npShannon指數(shù)均高于C3期和C1期，但Simpson指數(shù)最小，說明C2期羅非魚腸道中的微生物物種豐度最高，即羅非魚腸道微生物的多樣性排序?yàn)镃2期>C3期>C1期。

2. 2 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物物種組成差異分析結(jié)果

各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物種群數(shù)量占2.00%以上的有11個(gè)門，厚壁菌門（Firmicutes）為C1期和C2期的優(yōu)勢菌群，藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）為C3期的優(yōu)勢菌群（表3），其中厚壁菌門隨養(yǎng)殖周期的推移而逐漸減少，表現(xiàn)為C1期（37.13%）>C2期（33.11%）>C3期（17.33%）；變形菌門（Proteobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、TM7和TM6隨養(yǎng)殖周期的推移呈先增后降的變化趨勢；放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）則隨養(yǎng)殖周期的推移呈不斷增加趨勢（圖2）。

各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物種群數(shù)量占2.00%以上的屬有14個(gè)，分別是分枝桿菌屬（Mycobacterium）、暖繩菌屬（Caldilinea）、聚球藻屬（Synechococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、乳球菌屬（Lactococcus）、梭菌屬（Clostridium）、Cetobacterium、甲基彎曲菌屬（Methylosinus）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、Methylocaldum、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）（表4）。C1期的優(yōu)勢菌是乳球菌屬（14.96%），其次為梭菌屬（4.96%）和聚球藻屬（5.11%）；C2期的優(yōu)勢菌是乳球菌屬（12.68%），其次為假單胞菌屬（4.40%）和芽孢桿菌屬（3.73%）；C3期的優(yōu)勢菌也是聚球藻屬（4.49%），其次為乳球菌屬（4.15%）和芽孢桿菌屬（3.27%）。由圖3可看出，隨養(yǎng)殖周期的推移，乳球菌屬所占比例逐漸下降，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和分支桿菌屬則呈先增后減的變化趨勢。

從屬水平上的物種表達(dá)譜熱圖（圖4）可看出，養(yǎng)殖羅非魚腸道微生物主要聚為兩大分支，多數(shù)C1期和C3期聚為一支，多數(shù)C2期聚為一支，說明不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯。從圖4還可看出，鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、擬桿菌屬（Bacteroides）、棲水菌屬（Enhydrobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、乳球菌屬、詹森菌屬（Janthinobacteriu）、環(huán)絲菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬（Flavobacterium）、葡糖醋桿菌屬（Gluconobacter）、耶爾森菌屬（Yersi-nia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、沙雷氏菌屬（Srratia）等細(xì)菌在C2期中的豐度明顯高于C1期和C3期，其中多個(gè)屬為條件致病菌，說明C2期致病微生物的含量較高。

2. 3 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的菌群豐度差異分析結(jié)果

通過LEfSe分析組間菌群差異，可找出各組間特異的主要菌群。從圖5可看出，海南三江養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標(biāo)志（與其他兩個(gè)階段豐度差異顯著）微生物為暖繩菌目的暖繩菌科，C2期的標(biāo)志微生物主要有鏈球菌科、明串珠菌科、腸球菌科、肉桿菌科、氣球菌科、鞘脂桿菌科和擬桿菌科，C3期的標(biāo)志微生物是芽孢桿菌科和巴斯德氏菌科。海南屯昌養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標(biāo)志微生物為肉桿菌科和棲水菌屬，C2期的標(biāo)志微生物主要有芽孢桿菌科、動(dòng)性球菌科和巴斯德氏菌科，C3期的標(biāo)志微生物主要為節(jié)桿菌屬和微球菌科。海南文昌養(yǎng)殖羅非魚腸道在C1期的標(biāo)志微生物為棲水菌屬，C2期的標(biāo)志微生物主要為芽孢桿菌科和Pseudologum，C3期的標(biāo)志微生物主要是伯克氏菌屬和普氏菌屬?？梢?，不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標(biāo)記類群存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高。

3 討論

目前，有關(guān)羅非魚腸道微生物的研究多集中在不同營養(yǎng)元素、藥物或益生菌等添加對其多樣性的影響（徐勇等，2007；劉小玲等，2013），而針對不同環(huán)境或不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物多樣性研究較少。羅非魚養(yǎng)殖過程中存在的最突出問題是病害頻繁發(fā)生后導(dǎo)致抗生素濫用，因此如何運(yùn)用生態(tài)、健康的方式進(jìn)行病害防治已成為當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究熱點(diǎn)，其中益生菌在防治羅非魚病害方面表現(xiàn)出成本低、無藥物殘留及生態(tài)友好等明顯優(yōu)勢（趙光軍，2014；劉海天等，2016）。本研究全面系統(tǒng)分析了不同養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物的變化情況，發(fā)現(xiàn)羅非魚腸道微生物的物種豐度排序?yàn)轲B(yǎng)殖中期>養(yǎng)殖后期>養(yǎng)殖前期，其中α多樣性分析結(jié)果顯示，厚壁菌門和藍(lán)菌門占據(jù)優(yōu)勢地位，與淡水魚類腸道菌群的研究結(jié)果（Wu et al.，2010，2012）基本一致，說明厚壁菌門和藍(lán)菌門是魚類腸道的固有細(xì)菌門類，但其在不同魚類腸道中所發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步證實(shí)。

魚類腸道微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境、餌料和發(fā)育等因素密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為養(yǎng)殖水體中的微生物、鹽度、水溫，魚類攝食的餌料、藥物及其生理狀態(tài)和發(fā)育階段對魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)均有影響（陳孝煊等，2005）。本研究結(jié)果也顯示，不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標(biāo)記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)，但也存在相似之處，如養(yǎng)殖前期以棲水菌屬最具代表性，中期主要以芽孢桿菌科豐度最高。該結(jié)論可為羅非魚腸道益生菌的篩選提供科學(xué)依據(jù)，并指導(dǎo)羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中微生物制劑的科學(xué)使用，減少藥殘對生態(tài)環(huán)境的污染，進(jìn)而改善羅非魚的生長性能及其品質(zhì)等?？梢?，羅非魚腸道微生物資源豐富，具有極大的開發(fā)前景。

在研究方法上，汪立平等（2009）曾以不同方法提取羅非魚幼魚腸道微生物基因組DNA，再通過DGGE指紋圖譜初步分析微生物多樣性，但DGGE技術(shù)在靈敏度方面不及高通量測序技術(shù)，只能檢測出含量在0.50%以上的菌種，且對實(shí)驗(yàn)者的操作熟練度要求較高。本研究基于細(xì)菌16S rDNA高通量測序技術(shù)對海南省不同養(yǎng)殖地區(qū)整個(gè)養(yǎng)殖周期的羅非魚腸道微生物多樣性進(jìn)行分析，并證實(shí)采用高通量測序技術(shù)能檢測到含量在0.03%以下的菌種，其靈敏度遠(yuǎn)高于DGGE技術(shù)，故建議今后開展微生物多樣性分析時(shí)應(yīng)首選高通量測序技術(shù)。

4 結(jié)論

不同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物組成差異明顯，且不同地區(qū)相同養(yǎng)殖階段的羅非魚腸道微生物豐度差異標(biāo)記類群也存在一定差異，可能與魚種來源、養(yǎng)殖環(huán)境及飼料有關(guān)。因此，生產(chǎn)中應(yīng)結(jié)合實(shí)際情況，科學(xué)利用益生菌對羅非魚腸道和養(yǎng)殖環(huán)境中微生態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定向改良，切忌盲目使用益生菌。

參考文獻(xiàn)：

陳孝煊，吳志新，周文豪. 2005. 魚類消化道菌群的作用與影響因素研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，24（5）：523-528. [Chen X X，Wu Z X，Zhou W H. 2005. Study on the effects and influencing factors of microflora in the digestive tract of fish[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，24（5）：523-528.]

胡秀彩，李會(huì)，呂愛軍. 2010. 鯉魚腸道細(xì)菌的分離及其生理生化特性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，26（14）：365-367. [Hu X C，Li H，Lü A J. 2010. Isolation of bacteria from intestine in carp（Cyprinus Carpio） and their physiological and biochemical characteristics[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，26（14）：365-367.]

李鳳，劉世貴. 2003. 分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用[J]. 世界科技研究與發(fā)展，25（4）：88-92. [Li F，Liu S G. 2003. The application of molecular biotechnology in environmental microorganism research[J]. World Science and Technology Research and Development，25（4）：88-92.]

凌云，王輝，魏華，顧佳潔. 2010. PCR-DGGE技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用及發(fā)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，38（12）：6244-6246. [Ling Y，Wang H，Wei H，Gu J J. 2010. Application and development of PCR-DGGE in aquaculture[J]. Journal of Anhui Agricultural Science，38（12）：6244-6246.]

劉海天，趙光軍，郭曉慧，張永政，周永燦，蔡巖，謝珍玉，郭偉良，王世鋒. 2016. 無乳鏈球菌對羅非魚粘液的粘附特性[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，7（2）：153-158. [Liu H T，Zhao G J，Guo X H，Zhang Y Z，Zhou Y C，Cai Y，Xie Z Y，Guo W L，Wang S F. 2016. Adhesion of Streptococcus agalactiae to the mucus of tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Journal of Tropical Biology，7（2）：153-158.]

劉小玲，曹俊明，鄺哲師，王國霞，吳春玉，付晶晶，莫文艷，黃燕華. 2013. 嗜酸乳酸菌對吉富羅非魚生長、非特異性免疫酶活性和腸道菌群的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（1）：123-126. [Liu X L，Cao J M，Kuang Z S，Wang G X，Wu C Y，F(xiàn)u J J，Mo W Y，Huang Y H. 2013. Effect of dietary lactobacillus on growth performance，non-specific immune enzymes activities and intestinal microflora of Oreochromis niloticus[J]. Guangdong Agricultural Scien-ce，40（1）：123-126.]

呂欣榮，肖克宇. 2008. 魚類腸道菌群的研究現(xiàn)狀[J]. 江西水產(chǎn)科技，（2）：12-18. [Lü X R，Xiao K Y. 2008. Review on intestinal microflora in fish[J]. Jiangxi Fishery Science and Technology，（2）：12-18.]

秦楠，栗東芳，楊瑞馥. 2011. 高通量測序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，51（4）：445-457. [Qin N，Li D F，Yang R F. 2011. Next-generation sequencing technologies and the application in microbiology—A review[J]. Acta Microbiologica Sinica，51（4）：445-457.]

任南琪，趙陽國，高崇洋，王愛杰. 2007. TRFLP在微生物群落結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)分析中的應(yīng)用[J]. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（4）：552-556. [Ren N Q，Zhao Y G，Gao C Y，Wang A J. 2007. Terminal restriction fragment length polymorphism：A powerful technique for characterizing microbial community structure and dynamics[J]. Journal of Harbin Institute of Technology，39（4）：552-556.]

宋增福，吳天星. 2007. 魚類腸道正常菌群研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，26（8）：471-474. [Song Z F，Wu T X. 2007. Review on intestinal normal microflora in fish[J]. Fisheries Science，26（8）：471-474.]

孫嘉曼，韋弟，覃柳燕，魏源文，郭文峰，呂維莉，張進(jìn)忠，盧江. 2014. 高通量測序技術(shù)在香蕉抗枯萎病研究中的應(yīng)用[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（11）：1921-1925. [Sun J M，Wei D，Qin L Y，Wei Y W，Guo W F，Lü W L，Zhang J Z，Lu J. 2014. Application of high-throughput sequencing technology in banana resistant to Fusarium wilt[J]. Journal of Southern Agriculture，45（11）：1921-1925.]

覃映雪，王曉林，鄢慶枇，王赟，葉冬鳳. 2007. 青石斑魚腸道菌群研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，28（5）：18-23. [Qin Y X，Wang X L，Yan Q P，Wang Y，Ye D F. 2007. Study on the intestinal microflora of Epinephelus awoara[J]. Marine Fisheries Research，28（5）：18-23.]

汪立平，馬相杰，趙勇. 2009. 羅非魚幼魚腸道微生物基因組DNA的提取[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，（10）：147-150. [Wang L P，Ma X J，Zhao Y. 2009. Extraction of genomic DNA from intestinal microorganism of tilapia juvenile fish[J]. Hunan Agricultural Sciences，（10）：147-150.]

王紹祥，楊洲祥，孫真，劉燕，汪成偉，荊毓航. 2014. 高通量測序技術(shù)在水環(huán)境微生物群落多樣性中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)通報(bào)，77（3）：196-203. [Wang S X，Yang Z X，Sun Z，Liu Y，Wang C W，Jing Y H. 2014. Application of high throughput sequencing in the diversity of water microbial communities[J]. Chemistry，77（3）：196-203.]

徐勇，胡彩虹，熊莉，夏枚生. 2007. 黃霉素對尼羅羅非魚生長、微生態(tài)和免疫特性的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），35（9）：29-34. [Xu Y，Hu C H，Xiong L，Xia M S. 2007. Effects of flavomycin on the growth， microbial ecology and immune properties of tilapia nilai[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），35（9）：29 -34.]

許燕，王印庚，張正，姜燕，廖梅杰，李彬，王凱，李文生. 2018. 不同健康程度和抗生素氟苯尼考干預(yù)下斑石鯛腸道菌群的結(jié)構(gòu)差異[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，42（3）：388-398. [Xu Y，Wang Y G，Zhang Z，Jiang Y，Liao M J，Li B，Wang K，Li W S. 2018. Variance analysis of bacterial community in the intestine of cultured spotted knifejaw（Oplegnathus punctatus） at different healthy levels and intervened with florfenicol[J]. Journal of Fisheries of China，42（3）：388-398.]

葉雷，閆亞麗，陳慶森，趙林森，齡南，龐廣昌. 2016. 高通量測序技術(shù)在腸道微生物宏基因組學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中國食品學(xué)報(bào)，16（7）：216-223. [Ye L，Yan Y L，Chen Q S，Zhao L S，Ling N，Pang G C. 2016. Application of high-throughput sequencing technology in studying matagenomics of intestinal microbiota[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，16（7）：216-223.]

郁二蒙，畢香梅，謝駿，王廣軍，余德光，龔?fù)麑?，王海英，李志? 2012. 攝食不同餌料草魚腸道菌群 PCR-DGGE 指紋圖譜構(gòu)建及分子鑒定[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，（9）：179-184. [Yu E M，Bi X M，Xie J，Wang G J，Yu D G，Gong W B，Wang H Y，Li Z F. 2012. Construction of PCR-DGGE gene fingrtprint and molecular cloning for the intestinal bacterial community in Ctenopharyngodon idellus[J]. Biotechnology Bulletin，（9）：179-184.]

趙光軍. 2014. 拮抗菌的篩選及其對無乳鏈球菌粘附羅非魚粘液的拮抗作用研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué). [Zhao G J. 2014. The screening of antagonistic bacteria and its antagonism on the adhesion of Streptococcus agalactiae to the mucus of tilapia[D]. Haikou：Hainan University.]

趙明曉，賀永亮. 2008. 腸道細(xì)菌與宿主共生的研究進(jìn)展[J]. 重慶文理學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），27（2）：56-59. [Zhao M X，He Y L. 2008. Progress in the symbiosis of intestinal bacteria and host[J]. Journal of Chongqing University of Arts and Sciences（Natural Science Edition），27（2）：56-59.]

趙翔，安志東. 2003. 現(xiàn)代生物技術(shù)在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用：Ⅲ. 限制性片段長度多態(tài)性分析、變性/溫度梯度凝膠電泳和報(bào)道基因[J]. 氨基酸和生物資源，25（2）：48-51. [Zhao X，An Z D. 2003. Application of modern biotechnology to environmental microbiology：Ⅲ. Restriction fragment length polymorphism analysis，denaturing/temprature gradient gel electrophoresis and reporter genes[J]. Amino Acids & Biotic Resources，25（2）：48-51.]

周孟姣，劉臻. 2003. RAPD技術(shù)及其在蝦、蟹類研究中的應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，30（1）：25-28. [Zhou M J，Liu Z. 2003. RAPD technique and its application in the research of shrimps and crabs[J]. Fisheries Science & Technology Information，30（1）：25-28.]

Bosch T C，McFall-Ngai M J. 2011. Metaorganisms as the new frontier[J]. Zoology，114（4）：185-189.

Cheesman S E，Guillemin K. 2007. We know you are in there：Conversing with the indigenous gut microbiota[J]. Research in Microbiology，158（1）：2-9.

Dethlefsen L，McFall-Ngai M，Relman D A. 2007. An ecological and evolutinary perspective on human-microbe mutua-lism and disease[J]. Nature，449：811-818.

Goodman S E，Gordon J I. 2010. Our unindicated coconspirators： Human metabolism from a microbial perspective[J]. Cell Metabolism，12（2）：111-116.

Maidie A，Yoshijima T，Sugita H. 2003. Characterization of the goldfish fecal microflora by the fluorescent in situ hybridization method[J]. Fisheries Science，69（1）：21-26.

Savas S，Kabilay A，Basmaz N. 2005. Effect of bacterial load in feeds on intestinal microflora of seabream（Sparus aurata） larvae and juveniles[J]. The Israeli Journal of Aquaculture，57（1）：3-9.

Spanggaard B，Huber I，Nielsen J，NielsenT，Appel K F，Gram L. 2000. The microflora of rainbow trout intestine：A comparison of traditional and molecular identification[J]. Aquaculture，182（1）：1-15.

Wu S，Gao T，Zheng Y，Wang W，Cheng Y，Wang G. 2010. Microbial diversity of intestinal contents and mucus in yellow catfish（Pelteobagrus fulvidraco）[J]. Aquaculture，303（1-4）：1-7.

Wu S，Wang G，Angert E R，Wang W，Li W，Zou H. 2012. Composition，diversity，and origin of the bacterial community in grass carp intestine[J]. PLoS One，7（2）：e30440.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）