顧彩彩　王震　王露蓉　毛蓮英　宋奇琦　楊麗濤　邢永秀　李楊瑞

摘要：【目的】研究固氮菌株DX120E在甘蔗幼苗中的侵染定殖及其對(duì)不同甘蔗品種生長(zhǎng)生理的影響，為進(jìn)一步分析該固氮菌與甘蔗的相互作用機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳?個(gè)甘蔗品種ROC22、B8和GT21為試驗(yàn)材料，將DX120E用gfp基因標(biāo)記后，以浸根法接種甘蔗，觀察其在甘蔗中的侵染定殖情況，分別在接菌后60、90和120 d，調(diào)查甘蔗的株高、葉綠素含量及鮮重，并測(cè)定氮代謝關(guān)鍵酶活性指標(biāo)?！窘Y(jié)果】獲得了穩(wěn)定表達(dá)的DX120E-gfp接合子菌株；接種后第7 d ，在3個(gè)甘蔗品種的根部和葉片中均檢測(cè)出nifH基因表達(dá)，片段大小約為360 bp。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，接種后第7 d，固氮菌定殖在甘蔗的根毛區(qū)、新生側(cè)根處、根斷裂傷口處及葉片橫切處。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，接種固氮菌DX120E對(duì)3個(gè)甘蔗品種有明顯促生作用，與不接菌對(duì)照相比，接菌后120 d，ROC22、B8和GT21的株高分別增加23%、20%和14%，地上部分鮮重分別增加25%、31%和11%，地下部分鮮重分別增加40%、34%和30%。且3個(gè)甘蔗品種葉片的谷氨酰胺合成酶和硝酸還原酶活性總體上高于對(duì)照?！窘Y(jié)論】采用菌液浸根法接種甘蔗，固氮菌DX120E能在甘蔗根部定殖并向地上部分轉(zhuǎn)移定殖。采用該方法處理甘蔗，對(duì)甘蔗有明顯的促生效應(yīng)，但不同品種間存在一定差異。

關(guān)鍵詞： 甘蔗；固氮細(xì)菌；DX120E；促生效應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)： S566.1； Q939.113 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）06-1075-07

Abstract：【Objective】The infection and colonization of nitrogen-fixing bacteria DX120E in sugarcane seedlings and the effects on the growth and physiology in different sugarcane varieties were studied to provide reference for further ana-lysis of the interaction mechanism between nitrogen-fixing bacteria and sugarcane. 【Method】Sugarcane varieties ROC22，GT21and B8 were used as test materials. After DX120E was labeled with gfp gene， sugarcane was inoculated by root-soaking method， and infection and colonization of DX120E in sugarcane were observed. The plant height， chlorophyll content and fresh weight of sugarcane were investigated at 60， 90 and 120 d after inoculation， and the key enzyme activities of nitrogen metabolism were measured. 【Result】Stably expressed DX120E-gfp zygote strains was obtained. On day 7 after inoculation， nifH gene expression was detected in the roots and leaves of three sugarcane varieties， and the fragment size was approximately 360 bp. The results of fluorescence microscopy showed that on day 7 after inoculation， nitrogen-fixing bacteria was colonized in the root hair zone， the neonatal lateral roots， the root fracture wounds and the cross-sections of the leaves of sugarcane. Pot experiment showed that compared with the control of inoculation with no nitrogen-fixing bacteria， the sugarcane inoculated with nitrogen-fixing bacteria DX120E could effectively promote the growth of the three varieties. And 120 d after inoculation， the plant heights of ROC22， B8 and GT21 respectively increased by 23%， 20% and 14%； the fresh weight of aboveground increased by 25%， 31% and 11% respectively； the fresh weight of underground part increased by 40%，34% and 30% respectively. The activity of glutamine synthetase and nitrate reductase in leaves of the three sugarcane varieties was also higher than that of the control. 【Conclusion】By using the root-soaking method to inoculate sugarcane， the nitrogen-fixing bacteria strain DX120E can colonize the roots and transfer to the leaves of sugarcane. Using this method to treat sugarcane has obvious promoting effects on sugarcane， but there are some differences between different varieties.

Key words： sugarcane； nitrogen-fixing bacteria； DX120E； promoting effects

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國(guó)第一大糖料作物，也是目前極具發(fā)展?jié)摿Φ纳锬茉醋魑铮ɡ顥钊鸬龋?014）。廣西是我國(guó)甘蔗種植大?。▍^(qū)），蔗糖年產(chǎn)量約占全國(guó)總產(chǎn)量的70%，然而甘蔗生產(chǎn)中大量的氮肥施入田間后，通過(guò)氨的揮發(fā)、硝化—反硝化作用和表面流失等途徑導(dǎo)致氮肥利用率降低，同時(shí)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染及病蟲(chóng)害問(wèn)題。因此，研究和利用甘蔗生物固氮是減少氮肥施用及降低生產(chǎn)成本的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1958年，D?bereiner研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了甘蔗根際中的聯(lián)合固氮菌并證實(shí)禾本科植物存在生物固氮潛力（D?bereiner，1961）。內(nèi)生固氮菌侵入寄主植物的部位主要包括植物的表皮裂隙、傷口、根毛和主側(cè)根連接處等（James et al.，1994，2001）。已有研究表明，接種促生菌能提高甘蔗的鮮重和植株體內(nèi)礦質(zhì)元素含量，株高與產(chǎn)量也隨之增加，對(duì)甘蔗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用（李海碧，2017）。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)甘蔗內(nèi)生固氮菌的研究主要集中在甘蔗根際土壤固氮菌的鑒定及其多樣性、固氮菌接種對(duì)甘蔗生長(zhǎng)的影響及甘蔗與固氮菌的互作關(guān)系。Suman等（2005）研究表明，接種醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）后，甘蔗對(duì)氮的吸收和生長(zhǎng)速率加快。邢永秀（2006）、Magnani等（2010）用選擇性培養(yǎng)基通過(guò)平板稀釋法從甘蔗體內(nèi)分離培養(yǎng)出一批內(nèi)生固氮菌。黃杏等（2009）研究表明，用固氮菌（GGS6、CCT2和QZT2）的混合菌液接種甘蔗，甘蔗的根系活力、碳水化合物及蛋白質(zhì)含量均得到提高。羅霆等（2010）采用15N同位素稀釋法證明甘蔗的固氮含量和固氮百分率在接種固氮菌后得到提高。林麗（2011）從甘蔗品種新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22）根內(nèi)分離鑒定到固氮菌DX120E（Klebsiella sp.），并證實(shí)其具有高固氮酶活性。魏春燕等（2014）研究表明，甘蔗基因型對(duì)甘蔗與固氮菌間的聯(lián)合互作有影響。Castanheira等（2017）研究認(rèn)為，接種固氮菌可提高植物的生長(zhǎng)和生理特性，如提高葉片光合色素、脂質(zhì)生物合成和亞麻酸含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前關(guān)于固氮菌在甘蔗中的侵染定殖多采用組培苗進(jìn)行研究，以浸根法接種甘蔗幼苗的報(bào)道較少，且近年來(lái)從廣西甘蔗中分離并初步篩選出一些固氮能力較強(qiáng)的固氮菌株，其與甘蔗互作的機(jī)理尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用浸根法接種固氮菌DX120E，研究其對(duì)不同甘蔗品種的互作效應(yīng)，旨在為研究該固氮菌和甘蔗的相互作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種為B8、ROC22和桂糖2號(hào)（GT21）。供體菌大腸桿菌E. coli TG1/pPROBE-pTetr-OT攜帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因gfp和Smr標(biāo)記基因，助細(xì)菌為DH5α/pRK2013，均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供。DX120E菌種由亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。試驗(yàn)中用到的PCR相關(guān)產(chǎn)品購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，抗生素產(chǎn)品購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，其他化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 三親結(jié)合法轉(zhuǎn)化突變株 參考Bartosik等（2002）的方法，將培養(yǎng)過(guò)夜的DX120E、供體菌E. coli TG1/pPROBE-pTetr-OT和助細(xì)菌DH5α/pRK2013用無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)液清洗2次；取50 ?L供菌體、100 ?L DX120E和50 ?L助細(xì)菌（1∶2∶1）輕柔混合；取100 ?L混合菌液滴在無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)8 h；用無(wú)抗生素LB培養(yǎng)液懸浮長(zhǎng)出的菌體，取100 ?L涂布在含有抗生素的LB培養(yǎng)基上篩選DX120E/pPROBE-pTetr-OT。

1. 2. 2 轉(zhuǎn)化菌株中外源質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測(cè) 抗生素鏈霉素（Sm）和慶大霉素（Gm）被用作三親結(jié)合試驗(yàn)受體菌的篩選標(biāo)記，得到抗Sm（100 μg/mL）和Gm（15 μg/mL）的DX120E-gfp菌株。二抗平板上得到的結(jié)合子（DX120E-gfp菌株）在無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)30代，再將所得菌液用無(wú)菌水稀釋107倍，然后用玻璃棒涂布在含有抗生素（Sm100和Gm15）的LB培養(yǎng)基上，獲得穩(wěn)定表達(dá)的gfp結(jié)合子。

1. 2. 3 鑒定轉(zhuǎn)化子 將得到的結(jié)合子涂布在含有抗生素（Sm100和Gm15）的LB培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)并用體式熒光顯微鏡觀察。結(jié)合子中g(shù)fp基因的擴(kuò)增：挑取結(jié)合子，至其對(duì)數(shù)期時(shí)，取出50 μL液體離心后收集菌體，加入滅菌水50 μL后再離心，取1 μL上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1. 2. 4 菌懸液制備和接種處理 將獲得的穩(wěn)定表達(dá)gfp結(jié)合子在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑選其中的單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在600 nm下吸光值為1.0，離心后用滅菌水稀釋至107 CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 5 DX120E-gfp處理甘蔗及其在甘蔗中的定殖 待甘蔗幼苗長(zhǎng)出4片葉時(shí)，選擇健壯、無(wú)病蟲(chóng)害且長(zhǎng)勢(shì)一致的甘蔗苗，用水清洗干凈根部，然后在其根部接入無(wú)菌水懸浮的DX120E-gfp，浸泡根部40 min后移栽至塑料桶（桶口直徑36.3 cm、內(nèi)高30.0 cm）中。接種7 d后，取甘蔗幼苗的根系和葉片，無(wú)菌水漂洗并滅菌處理后用徒手切片法制作組織切片，將制作好的切片在體式熒光顯微鏡下觀察固氮菌在甘蔗各部位的存在狀態(tài)。

1. 2. 6 甘蔗不同部位nifH基因的檢測(cè) 設(shè)計(jì)DX120E的特異引物，以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Es Taq Mix 12.5 μL，滅菌水9.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為360 bp左右。

1. 2. 7 甘蔗株高、葉綠素含量和鮮重的測(cè)定 用塔尺測(cè)量甘蔗株高，即甘蔗根部到+1葉葉環(huán)處的長(zhǎng)度，測(cè)量3株取平均值。用葉綠素含量測(cè)定儀SPAD-502測(cè)定甘蔗+1葉的葉綠素含量（SPAD值）。將甘蔗植株的地上和地下部分分開(kāi)并用標(biāo)簽做好標(biāo)記，稱(chēng)量鮮重并記錄數(shù)據(jù)，每處理3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1. 2. 8 葉片酶活性檢測(cè) 2017年9～11月采樣，采樣時(shí)間為上午9：00～10：00。每處理隨機(jī)取3株，取樣部位為甘蔗+1葉，去掉葉片梢部用剪刀剪碎后包裹在錫紙中，放進(jìn)液氮中暫存，樣品采完后-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎帽壬y(cè)定谷氨酰胺合成酶活性（韋莉萍，2005），采用磺胺比色法測(cè)定硝酸還原酶活性（李合生，2000）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，并以Duncans進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

DX120E-gfp結(jié)合子在無(wú)抗性的LB培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)30代后，97%（291/300）結(jié)合子在含有Gm15和Sm100的培養(yǎng)基上可生長(zhǎng)，表明pPROBE-pTetr-OT在DX120E中的穩(wěn)定性較高，可用于下一步試驗(yàn)。

2. 2 gfp標(biāo)記菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果

將DX120E、助細(xì)菌和供體菌共培養(yǎng)后，在選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出一些結(jié)合子，熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)綠色熒光的結(jié)合子，但助細(xì)菌個(gè)體、受體菌和供體菌在選擇性培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，結(jié)合子可在無(wú)氮的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。篩選出的穩(wěn)定表達(dá)結(jié)合子在體式熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)每個(gè)單菌落均能發(fā)出綠色熒光（圖1）。將單菌落的結(jié)合子挑出，置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液進(jìn)行g(shù)fp片段的PCR擴(kuò)增，可獲得大小約118 bp的片段（圖2）。

2. 3 DX120E在甘蔗根部和葉片中的nifH檢測(cè)結(jié)果

接菌后第7 d，用DX120E的nifH基因片段序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果在甘蔗品種ROC22、GT21和B8的根部和葉片中均能檢測(cè)出nifH基因，其目的片段大小約360 bp（圖3）。除個(gè)別樣品外，3個(gè)甘蔗品種的對(duì)照均未檢測(cè)到nifH基因（圖4）。說(shuō)明在試驗(yàn)用的自然土中有其他固氮微生物進(jìn)入到甘蔗植株中。

2. 4 DX120E在甘蔗中的定殖情況

接種后第7 d，利用熒光顯微鏡觀察DX120E在甘蔗中的定殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在甘蔗的根毛（圖5-B）、主側(cè)根連接處（圖5-C）、根斷裂的傷口處（圖5-D、5-F）和根尖（圖5-E）處有較多的標(biāo)記菌株DX120E-gfp定殖，同時(shí)觀察到標(biāo)記菌株在葉片的橫切處定殖（圖5-G）。

2. 5 接菌對(duì)不同甘蔗品種株高、葉綠素含量及鮮重的影響

2. 5. 1 對(duì)株高的影響 由圖6可看出，與不接菌對(duì)照相比，接菌處理均可顯著提高3個(gè)甘蔗品種的株高（P<0.05，下同）。接菌后60、90和120 d，ROC22的株高分別較對(duì)照增高8%、18%和23%，B8的株高分別較對(duì)照增高8%、15%和20%，GT21的株高分別較對(duì)照增高6%、12%和14%。

2. 5. 2 對(duì)葉綠素含量的影響 由圖7可看出，接菌后60、90和120 d，ROC22和B8的葉片SPAD值均較對(duì)照顯著增加，GT21的SPAD值在接菌后90 d與對(duì)照差異不顯著（P>0.05，下同），接菌后60和120 d顯著高于對(duì)照。

2. 5. 3 對(duì)地上和地下部分鮮重的影響 由圖8和圖9可看出，與對(duì)照相比，接菌處理均可提高3個(gè)甘蔗品種的地上和地下部分鮮重。接菌后60 d，ROC22的地下部分鮮重及B8的地上和地下部分鮮重顯著高于對(duì)照，其余與對(duì)照差異不顯著。接菌后90 d，3個(gè)甘蔗品種的地上部分鮮重及B8的地下部分鮮重均顯著高于對(duì)照。接菌后120 d，3個(gè)甘蔗品種的地上和地下部分鮮重均顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照提高25%、31%、11%和40%、34%、30%。說(shuō)明接菌可促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng)，且對(duì)地上部分生長(zhǎng)的促進(jìn)作用早于地下部分。

2. 6 接菌處理對(duì)不同甘蔗品種酶活性的影響

2. 6. 1 對(duì)谷氨酰胺合成酶活性的影響 谷氨酰胺合成酶是涉及氨同化的關(guān)鍵酶，其活性在細(xì)胞內(nèi)多種氮代謝酶和部分糖代謝過(guò)程發(fā)揮重要作用（Bec-ker et al.，2000）。由圖10可看出，3個(gè)甘蔗品種的谷氨酰胺合成酶活性在接種后60、90和120 d均呈逐漸升高趨勢(shì)，且總體上高于其對(duì)照，其中接菌處理后60和90 d ROC22及處理后90 d B8的谷氨酰胺合成酶活性顯著高于對(duì)照。

2. 6. 2 對(duì)硝酸還原酶活性的影響 如圖11所示，接菌后60、90和120 d，ROC22和GT21的硝酸還原酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，B8的硝酸還原酶活性持續(xù)降低。與對(duì)照相比，接菌處理均可提高3個(gè)甘蔗品種的硝酸還原酶活性，其中接菌后90 d，3個(gè)甘蔗品種的硝酸還原酶活性均顯著高于對(duì)照，分別較對(duì)照提高21%、40%和10%。

3 討論

固氮菌與植物體發(fā)生聯(lián)合作用的決定性因素是固氮菌能否順利侵入植物體內(nèi)并在植物體內(nèi)定殖。利用免疫金標(biāo)技術(shù)發(fā)現(xiàn)固氮型內(nèi)生菌粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）能在水稻的根、莖、葉中定殖，同時(shí)該菌在已退化的皮層間隙及木質(zhì)部中大量存在（Gyaneshwar et al.，2001）。呂澤勛等（2001）利用激光共聚焦掃描電鏡觀察到根毛區(qū)是產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）在水稻中的主要存在部位，同時(shí)該菌可定殖在根皮層間隙、通氣組織和導(dǎo)管內(nèi)，在次生根形成處可見(jiàn)較大菌團(tuán)，在水稻根表其他區(qū)域形成的菌團(tuán)較小。Jha和Kumar（2007）通過(guò)組織染色試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，水稻根系的幼嫩側(cè)根處有可能是產(chǎn)酸克雷伯氏菌進(jìn)入的主要部位。本研究結(jié)果表明，用浸根法接種甘蔗，采用體式熒光顯微鏡觀察及PCR擴(kuò)增檢測(cè)，在甘蔗葉片中均成功檢測(cè)到DX120E菌株的存在。由此可見(jiàn)，浸根接種法能使DX120E進(jìn)入甘蔗幼苗的根內(nèi)及地上部分，且該菌能在甘蔗葉片中生存。即浸根接種法能使固氮菌在甘蔗根部定殖并向地上部分轉(zhuǎn)移定殖，為該固氮菌的進(jìn)一步研發(fā)提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，接種DX120E能顯著提高3個(gè)甘蔗品種的株高及地上和地下部分鮮重，與Suman等（2005）、林麗（2011）在甘蔗上的研究結(jié)果相似，即甘蔗接種固氮菌后，其對(duì)氮素的吸收增加，生長(zhǎng)速率加快，同時(shí)可提高甘蔗產(chǎn)量并促進(jìn)其增高，有效促進(jìn)甘蔗生長(zhǎng)。不同甘蔗品種的固氮能力存在差異，甘蔗基因型和環(huán)境因子在甘蔗固氮中具有重要作用（Carvalho et al.，2011）。王倫旺等（2010）研究表明，甘蔗品種B8的固氮能力較強(qiáng)。本研究中，接菌處理對(duì)ROC22和B8的促生效應(yīng)比GT21更明顯，說(shuō)明DX120E與ROC22和B8有較好的互作效應(yīng)。

在氮同化過(guò)程中，硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶是氮素同化的關(guān)鍵酶。本研究結(jié)果表明，采用浸根法接種甘蔗幼苗，均可在一定程度上提高3個(gè)甘蔗品種的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性，但品種間兩種酶活性的表現(xiàn)存在差異，ROC22和B8的硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶活性總體上高于GT21，與魏春燕等（2014）用固氮菌接種甘蔗組培苗的研究結(jié)果相似，其原因可能是ROC22和B8對(duì)固氮菌DX12E的響應(yīng)能力強(qiáng)于GT21。本研究結(jié)果在一定程度上豐富了固氮菌與寄主植物互作的相關(guān)研究，為研究有益固氮菌及開(kāi)發(fā)菌肥提供了參考。但本研究是在溫室條件下進(jìn)行，考慮到大田生產(chǎn)中會(huì)受到較多外界環(huán)境因素的影響，后續(xù)工作應(yīng)側(cè)重開(kāi)展田間接種試驗(yàn)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該菌株的固氮潛能。

4 結(jié)論

采用菌液浸根法接種甘蔗，固氮菌DX120E能在甘蔗根部定殖并向地上部分轉(zhuǎn)移定殖。采用該種方法處理甘蔗，對(duì)甘蔗有明顯的促生效應(yīng)，但不同品種間存在一定差異。

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（責(zé)任編輯 王 暉）