包志遠(yuǎn) 曲繼鵬 楊在君 路璐 廖明莉 周夢(mèng)霞 彭正松

摘 要：為了解四川風(fēng)鈴草屬植物的資源豐富度和遺傳進(jìn)化情況，該研究利用ISSR分子標(biāo)記，探究了四川7種風(fēng)鈴草屬植物的親緣關(guān)系，為風(fēng)鈴草屬植物的分子標(biāo)記輔助鑒定、資源保護(hù)、花卉品種的開(kāi)發(fā)與育種提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：40條ISSR引物中有28條引物能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，擴(kuò)增總條帶數(shù)為164，其中有98.8%的擴(kuò)增條帶具有多態(tài)性，供試的7種風(fēng)鈴草屬植物遺傳相似性系數(shù)在0.421～0.945之間，其中鉆裂風(fēng)鈴草與藏滇風(fēng)鈴草的遺傳相似度最高為0.945，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系很近。此外，ISSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果表明，7種風(fēng)鈴草屬植物可以明顯聚為4大類：西南風(fēng)鈴草、灰毛風(fēng)鈴草、灰?guī)r風(fēng)鈴草為一類；紫斑風(fēng)鈴草與流石風(fēng)鈴草各成一類，這兩種在形態(tài)上與其它各種風(fēng)鈴草差異較大；最后是鉆裂風(fēng)鈴草與藏滇風(fēng)鈴草為一類。

關(guān)鍵詞：風(fēng)鈴草屬，ISSR分子標(biāo)記，遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S688

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2018）06081807

Abstract： Genetic relationships among seven species in Campanula L. were investigated by intersimple sequence repeat molecular markers （ISSR）. The results showed that 28 of 40 primers can be amplified to clear bands. All the 28 ISSR primers amplified 164 bands，and the proportion of polymorphic fragment was 98.8%. The value of genetic similarity （GS） indexes of seven species based on the ISSR data varied from 0.421 to 0.945，and the highest genetic similarity was 0.945 between C. aristata and C. modesta，which indicated that they had closely relative relationship. Cluster analysis showed that all the species could be divided into four groups：C. colorata，C. cana and C. calcicola in the first group，C. calcicola in the second group，C. crenulata in the third group，and C. aristata and C. modesta in the last group. This study provides reference for the molecular marker assisted identification，resource conservation，flower variety development and breeding of Campanula.

Key words： Campanula L.，ISSR molecular marker，genetic diversity

風(fēng)鈴草屬（Campanula L.），是桔?？浦参镏蟹N類最多的一個(gè)屬，包含了一年生植物和多年生植物共580～600種，主要分布于北半球，其中以地中海流域作為主要分布點(diǎn)（Sáez & Aldasoro，2003）。中國(guó)分布有19種，主要分布于西南山區(qū)（四川植物志編輯委員會(huì)，1999； 中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1990）。風(fēng)鈴草屬植物的花冠似鈴鐺，花單生或多朵組成聚傘花序，花瓣5枚，瓣大，顏色大多呈現(xiàn)藍(lán)紫色或藍(lán)色，可作為觀賞類花卉應(yīng)用于園林景觀。目前對(duì)于風(fēng)鈴草屬植物的研究主要集中在物種的鑒定及分類（Birol，2004； Yildirim & Senol，2014）、自交不親和（GoodAvila et al，2008； GoodAvila & Stephenson，2003； Caser et al，2010）和傳粉機(jī)制等方面（Schlindwein et al，2005； Paulo et al，2015）。關(guān)于風(fēng)鈴草屬植物親緣關(guān)系的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。而開(kāi)展風(fēng)鈴草屬植物親緣關(guān)系的研究對(duì)該屬植物的鑒定、園林花卉品種的選育和雜交育種等工作具有重要的意義。

ISSR（intersimple sequence repeat），即簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增，是1994年由Zietkiewicz et al（1994）創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物研究中。ISSR的基本原理就是以短重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）為引物，來(lái)擴(kuò)增兩個(gè)序列相同但方向相反微衛(wèi)星重復(fù)序列之間的DNA片段（劉君等，2012； 盧家仕等，2013； Phong et al，2011）。ISSR引物設(shè)計(jì)不需要像SSR那樣需要預(yù)先獲知基因組序列，而是通過(guò)在SSR的3′或5′端錨定1～4個(gè)隨機(jī)簡(jiǎn)并核苷酸作為引物。相對(duì)于其它分子標(biāo)記而言，ISSR分子標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、快捷，同時(shí)兼?zhèn)銩FLP、SSR和RAPD等分子標(biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)（Lisek & Rozpara，2010； Sharma et al，2015； Jabbarzadeh et al，2013）。ISSR標(biāo)記以其高多態(tài)性，已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化以及SSR引物開(kāi)發(fā)等方面的研究（Wang et al，2013； 王惠梅等，2015）。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)分布于四川的7種風(fēng)鈴草植物的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，旨在了解四川風(fēng)鈴草屬植物的資源豐富度和遺傳進(jìn)化情況，為風(fēng)鈴草屬植物的分子標(biāo)記輔助鑒定、資源保護(hù)、花卉品種的開(kāi)發(fā)與育種提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年6—8月，分別在四川風(fēng)鈴草屬植物的主要分布區(qū)康定、稻城、鄉(xiāng)城和城口等地采集了7種風(fēng)鈴草屬植物。每個(gè)物種隨機(jī)選取20個(gè)個(gè)體的新鮮葉片混合，硅膠迅速干燥后保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)材料的具體信息如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 7種風(fēng)鈴草植物DNA的提取 利用多糖多酚植物DNA提取試劑盒（鐘鼎生物，江蘇）分別提取7種風(fēng)鈴草葉片的基因組DNA。具體操作參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA的質(zhì)量和完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用NanoDrop2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度。提取的DNA儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系建立及引物篩選 選取40條ISSR引物序列，引物由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為10 μL，包括5 μL 2×TaqPCR MasterMix（TIANGEN，北京）；3 μL ddH2O；1 μL（10 ng·μL1）引物；1 μL基因組DNA。PCR的擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，40～70 ℃ （退火溫度根據(jù)具體引物而定）退火30 s，72 ℃延伸1 min，總共45個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72 ℃繼續(xù)延伸5 min，最后4 ℃保存。并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照并保存圖片。

1.2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)成像的結(jié)果，在圖譜同一位置上有電泳條帶的賦值為1，反之為0，最終的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表現(xiàn)為0和1的矩陣圖。利用Anderson et al（1993）方法計(jì)算出PIC的值，即多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）。計(jì)算公式：

式中，Pij表示標(biāo)記i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率，PIC值的大小與多態(tài)性的高低密切相關(guān)，PIC值越大，表明多態(tài)性越高，其最大值為1，最小值為0。

利用聚類分析軟件NTSYS2.1計(jì)算材料之間的遺傳相似系數(shù)（GS），分析材料間的遺傳差異，并通過(guò)UPGMA方法對(duì)7種風(fēng)鈴草屬植物進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR分子標(biāo)記多態(tài)性分析

從40個(gè)ISSR引物中篩選出28個(gè)（70%）能在風(fēng)鈴草屬植物中擴(kuò)增出清晰條帶的引物，各引物的擴(kuò)增總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性比率、多態(tài)信息量見(jiàn)表2。28個(gè)引物總共擴(kuò)增出164條條帶，每個(gè)引物所擴(kuò)增的條帶數(shù)范圍為3～10條，平均5.9條。164個(gè)條帶中，有162個(gè)條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性條帶百分率達(dá)到98.8%。其中，引物UBC856擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為10條；引物UBC827、UBC829、UBC847擴(kuò)增出來(lái)的條帶數(shù)最少，均為3條。按照Anderson et al（1993）的方法計(jì)算了各引物所擴(kuò)增的位點(diǎn)多態(tài)性信息量（PIC）的值。PIC值的范圍為0.571～0.954，均值為0.785。PIC值在0.7以下的只有引物UBC827、UBC828、UBC847，其中最小的為引物UBC827，其值為0.571。PIC值最大的為引物UBC829，其值高達(dá)0.954。其中，引物UBC846的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 遺傳差異分析

風(fēng)鈴草屬植物各種間的遺傳相似系數(shù)（GS）見(jiàn)表3，其變化范圍為0.421～0.945，變化范圍較大。其中，西南風(fēng)鈴草與灰毛風(fēng)鈴草、藏滇風(fēng)鈴草與鉆裂風(fēng)鈴草的遺傳相似性很高，遺傳距離很小，GS值分別為0.823和0.945。紫斑風(fēng)鈴草、流石風(fēng)鈴草以及灰?guī)r風(fēng)鈴草與其它風(fēng)鈴草之間的GS值都比較小，說(shuō)明這三種風(fēng)鈴草與其它風(fēng)鈴草的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也符合它們的形態(tài)學(xué)特征。其中紫斑風(fēng)鈴草與鉆裂風(fēng)鈴草的GS值最小為0.421，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 聚類分析

利用ISSR遺傳相似性矩陣按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了7種風(fēng)鈴草屬植物的聚類圖（圖2）。圖2聚類結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.50時(shí)，7個(gè)物種可以聚為兩大類，其中西南風(fēng)鈴草、灰毛風(fēng)鈴草、紫斑風(fēng)鈴草以及灰?guī)r風(fēng)鈴草為第一大類；鉆裂風(fēng)鈴草、藏滇風(fēng)鈴草以及流石風(fēng)鈴草為第二大類。從圖2還可發(fā)現(xiàn)，在不同的遺傳相似性水平上，第一大類和第二大類又可以繼續(xù)分出亞類，例如：當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.54時(shí)，第一大類分出了兩個(gè)亞類，第一大亞類為西南風(fēng)鈴草、灰毛風(fēng)鈴草以及灰?guī)r風(fēng)鈴草，第二大亞類為紫斑風(fēng)鈴草。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.59時(shí)，第二大類也分出了兩個(gè)亞類，第一大亞類為流石風(fēng)鈴草，第二大亞類為藏滇風(fēng)鈴草和鉆裂風(fēng)鈴草。當(dāng)遺傳相似性系數(shù)為0.95時(shí)，七種風(fēng)鈴草全部被區(qū)分開(kāi)。

3 討論與結(jié)論

風(fēng)鈴草屬植物種類較多，但在中國(guó)的分布較少，僅有19種，其中四川也只分布有9個(gè)種 （四川植物志編輯委員會(huì)，1999； 中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1990）。本研究在實(shí)驗(yàn)材料的采集過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，風(fēng)鈴草屬植物生長(zhǎng)海拔普遍較高，除紫斑風(fēng)鈴草外，其它種均分布在海拔2 500 m以上的高山草甸。這些高山草甸是當(dāng)?shù)啬撩竦闹饕拍羺^(qū)，風(fēng)鈴草屬植物也是牦牛、馬等家畜的食物，因此風(fēng)鈴草屬植物受家畜的干擾很大，加之其生長(zhǎng)海拔高、環(huán)境惡劣，風(fēng)鈴草屬植物的生存環(huán)境受到極大的威脅。目前，采集該屬植物的標(biāo)本越發(fā)困難，因此開(kāi)展該屬植物資源調(diào)查、親緣關(guān)系研究和引種栽培等研究迫在眉睫。ISSR標(biāo)記具有多態(tài)性水平高、DNA用量少、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物親緣關(guān)系的分析（林樂(lè)靜等，2015； 謝偉玲等，2017； 陳宗游等，2017）。本研究從40條ISSR引物中篩選出28條能在7種風(fēng)鈴草屬植物中擴(kuò)增出清晰且多帶性高的條帶，它們可以直接應(yīng)用于這7種風(fēng)鈴屬植物的親緣關(guān)系分析。

28條引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)為164，其中有98.8%的擴(kuò)增條帶具有多態(tài)性，遺傳相似性系數(shù)在0.421～0.945之間，且物種間遺傳相似性系數(shù)變化較大。這表明ISSR可以較好地反應(yīng)風(fēng)鈴草屬植物種間的親緣關(guān)系。供試的7種風(fēng)鈴草屬植物中，鉆裂風(fēng)鈴草與藏滇風(fēng)鈴草，西南風(fēng)鈴草與灰毛風(fēng)鈴的親緣關(guān)系較近?？赡苁且?yàn)殂@裂風(fēng)鈴草與藏滇風(fēng)鈴草，西南風(fēng)鈴草與灰毛風(fēng)鈴草的生存環(huán)境非常相似且分布區(qū)域存在重疊，在長(zhǎng)期的自然演變過(guò)程中種質(zhì)相互滲透造成的。聚類結(jié)果表明，7種風(fēng)鈴草屬植物可以明顯地聚為4大類。西南風(fēng)鈴草、灰毛風(fēng)鈴草、灰?guī)r風(fēng)鈴草聚為一類，這3個(gè)物種具有相似的形態(tài)特征，如根胡蘿卜狀，葉小、邊緣有鋸齒、背面有氈毛，花冠多呈紫色等（中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1990）；紫斑風(fēng)鈴草與流石風(fēng)鈴草各自單獨(dú)成一類，這兩種在形態(tài)上與其它各種風(fēng)鈴草差異較大；最后是鉆裂風(fēng)鈴草與藏滇風(fēng)鈴草為一類。這也說(shuō)明了形態(tài)特征相似的物種往往具有較近的親緣關(guān)系。通過(guò)聚類結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)7種風(fēng)鈴草ISSR分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的分類的結(jié)果基本一致。這進(jìn)一步證實(shí)ISSR分子標(biāo)記可以對(duì)依靠表型為主的經(jīng)典植物分類方法起到一個(gè)補(bǔ)充作用（Nagaraju et al，2002）。

風(fēng)鈴草屬植物的花冠似鈴鐺、花大且顏色豐富，具有極高的觀賞價(jià)值。我國(guó)風(fēng)鈴草屬植物資源并不豐富，且較多集中于川西地區(qū)，加上人為干擾影響，對(duì)原始生態(tài)環(huán)境的破壞，風(fēng)鈴草屬資源受到了嚴(yán)重的威脅。因此，需要積極開(kāi)展風(fēng)鈴草屬植物的野生資源調(diào)查、引種馴化研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)雜交育種培育出觀賞價(jià)值高的新品種。一般而言，親本之間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交后代雜種優(yōu)勢(shì)越明顯，但雜交成功率也越低。因此，育種者充分掌握材料的遺傳背景信息、有針對(duì)地選配親本是風(fēng)鈴草屬雜交育種的重要內(nèi)容。本研究通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)風(fēng)鈴草屬植物的親緣關(guān)系進(jìn)行了客觀的分析，為該屬植物的雜交育種和分子標(biāo)記輔助鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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