磨正遵 商飛飛 潘中田 張麗鮮 李思思

摘要：【目的】優(yōu)化超聲波輔助提取廣西大果山楂葉黃酮的工藝條件，為廣西大果山楂葉資源的開發(fā)利用提供技術參考?！痉椒ā恳詮V西大果山楂葉為原料，以超純水為提取劑，通過單因素及響應面試驗對超聲波輔助提取山楂葉黃酮工藝進行優(yōu)化，探討超聲波功率、提取溫度、提取時間和料液比4個因素對黃酮提取率的影響?！窘Y果】通過響應面試驗建立二次多項回歸方程：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2（Y為黃酮提取率，A為提取溫度，B為提取時間，C為料液比）。超聲波輔助提取廣西大果山楂葉黃酮的最佳工藝條件為：超聲波功率140 W、提取溫度59 ℃、提取時間120 min、料液比1∶56（g/mL），在此條件下黃酮提取率為54.18 mg/g，與預測值53.86 mg/g的誤差小。3個因素對廣西大果山楂葉黃酮提取率影響主次排序為料液比>提取溫度>提取時間，提取溫度與料液比的交互作用對山楂葉黃酮提取率有顯著影響（P<0.05）?！窘Y論】響應面優(yōu)化得到的超聲波輔助水提廣西大果山楂葉黃酮工藝具有提取率高、精度高、工藝穩(wěn)定的優(yōu)點，可在生產(chǎn)中推廣應用。

關鍵詞： 廣西大果山楂葉；黃酮；超聲波輔助提??；響應面法

中圖分類號： S661.5 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-0986-07

Abstract：【Objective】The technology condition of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Guangxi big fruit hawthorn leaves was optimized in order to provide technical reference for the resource utilization of Guangxi big fruit hawthorn leaves. 【Method】The ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from hawthorn leaves was optimized by using single factor and response surface test， taking the Guangxi big fruit hawthorn leaves as the raw material， and ultra-pure water as the extractant. The effects of four factors including ultrasonic power， extraction temperature， extraction time and solid liquid ratio on extraction rate of flavonoids were studied. 【Result】According to response surface test， the quadratic regression model equation was established：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2（Y referred to the extraction rate of flavonoids； A referred to extraction temperature； B referred to extraction time； and C referred to solid liquid ratio）. The optimum technology conditions for ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from big fruit hawthorn leaves were as follows：the ultrasonic power was 140 W； the extraction temperature 59 ℃； extraction time 120 min and solid liquid ratio 1∶56（g/mL）. Under such conditions，the extraction rate of flavonoid was 54.18 mg/g and the error was small compared with the predictive value（53.86 mg/g）. According to importance order， the influence of the three factors on the extraction rate of flavonoids from Guangxi big fruit hawthorn leaves was solid liquid ratio> extraction temperature>extraction time. And the interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio had significant influence on the extraction rate of flavonoids from hawthorn leaves（P<0.05）. 【Conclusion】The ultrasonic-assisted water extraction optimized by response surface has following advantages：high extraction rate， high precision and stable technology， so it can be used for the promotion and application in production.

Key words： Guangxi big fruit hawthorn leaf； flavonoids； ultrasonic-assisted extraction； response surface methodology

0 引言

【研究意義】山楂為薔薇科山楂屬，在我國廣西、廣東、云南、河南和山東等地種植，是我國特有的藥果兼用樹種之一。其品種通常分為南北山楂兩類，山里紅稱為北山楂，野山楂俗稱南山楂，果實直徑1.0～1.5 cm。山楂葉化學成分主要為三萜類和黃酮類物質，其中黃酮類具有降血脂（蘇曼曼等，2007）、降血糖、預防肝損傷（郭菁菁和楊秀芬，2008）、抗氧化（曹劍鋒等，2016）及提高機體免疫力（房磊，2016）等生理活性。廣西大果山楂屬于南山楂的一種，由小果南山楂經(jīng)選育嫁接而成，與普通山楂相比，大果山楂果粒大，最大可達300 g，直徑在4.0～6.0 cm；大果山楂葉呈綠色尖狀，與北山楂葉的多棱角狀不同，且含有較多的有益成分，在2015年版《中國藥典》中再次被收錄。據(jù)統(tǒng)計，2016年廣西大果山楂種植面積超過1.67萬ha（陳兵兵等，2017）。廣西大果山楂在收果后，山楂葉常被丟棄，造成環(huán)境污染及資源浪費。因此，研究大果山楂葉黃酮的提取方法，可為大果山楂葉綜合開發(fā)利用提供途徑，解決不合理的資源浪費?！厩叭搜芯窟M展】前人對山楂黃酮的提取已有不少研究報道。韓秋菊（2011）以乙醇為提取溶劑，通過單因素及正交試驗優(yōu)化微波提取山楂黃酮工藝，得到黃酮提取率34.7 mg/g；李寧豫等（2013）以乙醇為提取溶劑，采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取山楂黃酮工藝，在固液比1∶20、乙醇體積分數(shù)80%、超聲功率60 W、超聲時間25 min的條件下得到黃酮提取率為4.11%；施紅林等（2014）利用響應面分析法優(yōu)化乙醇提取山楂葉中黃酮，在最佳工藝條件（液固比29∶1 mL/g、乙醇體積分數(shù)68%、提取溫度64 ℃、提取時間34 min）下黃酮粗提取率為30.7 mg/g；夏成凱等（2014）采用乙醇與醋酸乙酯混合法對山楂葉黃酮進行提取；劉偉等（2016）對比常溫浸提、索氏提取和超聲提取3種方法提取準噶爾山楂葉總黃酮的效果，結果發(fā)現(xiàn)超聲提取法較其他兩種提取法操作簡單、耗時少、提取效率高?！颈狙芯壳腥朦c】目前，前人對北方品種的山楂葉研究較多（施紅林等，2014；夏成凱等，2014；劉偉等，2016），且大多采用有機溶劑提取，極易造成環(huán)境污染，而針對廣西大果山楂葉黃酮水提工藝的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以自然曬干的廣西賀州大果山楂葉為試驗材料、以水為提取溶劑，通過單因素試驗和響應面法篩選出超聲波輔助提取廣西大果山楂葉黃酮的最佳工藝條件，為更好地利用廣西山楂資源提供技術參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

山楂葉采摘于賀州學院大果山楂種植基地，烘干后粉碎，過80目篩。蘆丁對照品（含量>98%）購自上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備：DFY-600高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）、KQ-5200DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、UV1901PC紫外可見分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）、L-550離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、BSA124S電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、Advanced-II-40超純水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 工藝流程 準確稱取1.00 g山楂葉粉末樣品置于小燒杯中，加入適量水溶液，在一定超聲波功率下提取一定時間后冷卻至室溫；然后離心，收集上清液于100.0 mL容量瓶定容；取2.0 mL提取液于25.0 mL容量瓶，測其吸光值。

1. 2. 2 蘆丁標準曲線制作 取蘆丁標準品粉末20.0 mg置于50.0 mL燒杯中，用60%乙醇溶解后倒入100.0 mL容量瓶中，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得到0.2 mg/mL蘆丁溶液；移取蘆丁溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL分別置于25.0 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液至10.0 mL，然后分別加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6 min；加入1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min后再加入1.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后分別加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后在500 nm波長下用分光光度計測其吸光值。以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標，制作標準曲線（趙躍剛等，2011）。

1. 2. 3 單因素試驗 依次對影響廣西大果山楂葉黃酮提取效果的4個因素進行單因素試驗，以獲得各因素適宜水平值。每個單因素試驗得到的最優(yōu)值作為下一組單因素的固定條件值，每個試驗重復3次。

超聲波功率選擇：固定料液比1∶32（g/mL，下同）、提取時間60 min、提取溫度50 ℃，分別在120、140、160、180和200 W下提取廣西大果山楂葉黃酮。提取溫度選擇：固定料液比1∶32、超聲波功率140 W、提取時間60 min，分別在35、40、50、60、70和80 ℃下提取黃酮。提取時間選擇：固定料液比1∶32、超聲波功率140 W、提取溫度50 ℃，分別在30、60、90、120、150和180 min下提取黃酮。料液比選擇：固定提取時間120 min、超聲波功率140 W、提取溫度50 ℃，分別在1∶16、1∶24、1∶32、1∶40、1∶48和1∶56下提取黃酮。

黃酮提取率（mg/g）=C×V/W

式中，C為黃酮質量濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），W為山楂葉樣品質量（g）。

1. 2. 4 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken中心設計方法設計響應面試驗，確定廣西大果山楂葉黃酮超聲波輔助提取最佳工藝條件。以提取溫度、提取時間和料液比為自變量，黃酮提取率為響應值，設17個處理組。試驗水平設計見表1。

1. 2. 5 驗證試驗 在超聲波輔助提取的最佳工藝條件下進行3次試驗，驗證提取條件優(yōu)化的可靠性和穩(wěn)定性。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2017處理試驗數(shù)據(jù)，用OriginPro 8.5和Design-Expert 10.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 蘆丁標準曲線

以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準曲線（圖1），得到回歸直線方程為y=20.9x-0.0001（R2=0.99985），吸光值線性范圍為0～0.9992，標準曲線濃度范圍內(nèi)線性良好。

2. 2 單因素試驗結果

2. 2. 1 超聲波功率對廣西大果山楂葉黃酮提取率的影響 由圖2可知，在超聲波功率120～200 W范圍內(nèi)，廣西大果山楂葉黃酮提取率分別為41.54、42.80、39.53、41.10和41.09 mg/g，不同超聲波功率對黃酮提取率的影響在2.00 mg/g之內(nèi)，說明小范圍內(nèi)調(diào)整超聲波功率對黃酮提取影響不明顯。這是由于小功率范圍內(nèi)超聲波產(chǎn)生的熱效應較小，120～200 W超聲波功率未對廣西大果山楂葉黃酮造成破壞。綜合考慮提取率和能耗等因素，選取140 W為最佳超聲波功率進行后續(xù)試驗。

2. 2. 2 提取溫度對廣西大果山楂葉黃酮提取率的影響 由圖3可知，提取溫度為50 ℃時，廣西大果山楂葉黃酮提取率達最大值；提取溫度在35～50 ℃時，黃酮提取率隨提取溫度的升高而逐漸增大；當提取溫度在50～70 ℃時，隨提取溫度的升高黃酮提取率反而逐漸減小。這是因為以水作為溶劑提取黃酮時，隨著提取溫度的升高，分子熱運動加劇，分子擴散速度增加，越來越多黃酮分子進入水中，但溫度過高時，黃酮結構被破壞，導致黃酮損失。70 ℃之后黃酮提取率又增加，是由于提取溫度70 ℃是臨界值，在50～70 ℃提取率比損失率小，70～80 ℃的提取率比損失率大。綜合考慮黃酮提取率和能耗等因素，選取40、50和60 ℃ 3個水平進行響應面試驗。

2. 2. 3 提取時間對廣西大果山楂葉黃酮提取率的影響 由圖4可知，廣西大果山楂葉黃酮提取率在提取時間為120 min時達最大值；提取時間小于120 min時，黃酮提取率隨提取時間延長呈上升趨勢，因為隨著提取時間的延長，熱運動增加，導致分子擴散速度加快。提取時間超過120 min后，黃酮提取率逐漸下降，是由于提取時間過長，熱效應致使部分黃酮類化合物損失，從而影響提取率。綜合考慮黃酮提取率和能耗等因素，選取90、120和150 min 3個水平進行響應面試驗。

2. 2. 4 料液比對廣西大果山楂葉黃酮提取率的影響

由圖5可知，廣西大果山楂葉黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大而增大，料液比為1∶16～1∶40的影響最明顯。這是因為隨著提取溶劑用量的增大，山楂葉粉末與水接觸面積增加，加快了黃酮類化合物溶出，且水的用量越大，后續(xù)步驟耗能相應增加。綜合考慮提取率和能耗等因素，選取1∶40、1∶48和1∶56 3個水平進行響應面試驗。

2. 3 響應面分析法優(yōu)化結果

在單因素試驗的基礎上，選取對廣西大果山楂葉黃酮提取率影響明顯的3個因素（提取溫度、提取時間、料液比）進行響應面試驗，利用Design-Expert 10.0對響應面試驗結果（表2）進行多元回歸擬合，得到山楂葉黃酮提取率（Y）對提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）的二次多項式回歸模型：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2。回歸方程中二次項A2、B2和C2的系數(shù)均為負數(shù)，說明回歸方程存在穩(wěn)定點（姜曉嬌和王承明，2010），即存在極大值。

對該模型進行方差分析，結果（表3）表明，回歸模型P<0.0001，在a=0.01水平下為極顯著，因變量和3個自變量間的線性關系極顯著（R2=0.986），說明模型能解釋98.6%的響應值變化，誤差也較小，模型F為54.29814。通過觀察回歸方程可知，各因素間相互影響，由表3可知A、B、C、A2、B2和C2對山楂葉黃酮提取率影響極顯著（P<0.01），AC對山楂葉黃酮提取率影響顯著（P<0.05，下同），AB和BC均不顯著（P>0.05，下同）。3個因素對廣西大果山楂葉黃酮提取率影響主次排序為C>A>B，即料液比>提取溫度>提取時間，交互作用的影響排序為AC>AB>BC。

2. 4 響應曲面圖分析結果

料液比、提取溫度和提取時間3個因素在反應過程中的相互作用見圖6～圖8。曲線走勢越陡，表明該因素影響越顯著；曲線走勢越平滑，則表明該因素影響較?。ㄚw強等，2012；李春榮等，2016）。等高線為橢圓形表示兩因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。從圖6～圖8可看出，提取溫度、料液比和提取時間圖形曲線走勢較陡，說明其影響顯著；提取溫度與提取時間、提取時間與料液比的等高線均呈圓形，說明兩因素間的交互作用對黃酮提取率影響不顯著；提取溫度與料液比的等高線呈橢圓形，說明兩者間交互作用對黃酮提取率影響顯著。

2. 5 驗證試驗結果

由Design-Expert 10.0擬合得到超聲波輔助提取廣西大果山楂葉黃酮的最佳工藝參數(shù)為：超聲波功率140 W、提取溫度59.01 ℃、提取時間2.11 h、料液比1∶55.81。為方便實際操作，修正工藝參數(shù)為：超聲波功率140 W、提取溫度59 ℃、提取時間120 min、料液比1∶56，在此優(yōu)化條件下進行3次驗證試驗，得到廣西大果山楂葉黃酮提取率平均值為54.18 mg/g，與預測值53.86 mg/g誤差小，表明優(yōu)化工藝穩(wěn)定，重復性好。

3 討論

目前已有一些關于山楂黃酮提取工藝的研究，袁冬梅和李一婧（2007）利用甲醇結合微波提取山楂葉黃酮；周海旭等（2011）以乙醇為溶劑，利用響應面法優(yōu)化山楂葉黃酮提取工藝；郭梅等（2012）通過正交試驗優(yōu)化微波輔助提取山楂中黃酮類化合物工藝，但這些研究均以有機溶劑為提取劑對黃酮進行提取，污染較高。本研究利用超純水為提取劑，在實際生產(chǎn)中可避免有機溶劑造成的黃酮污染，一定程度上提高了水提法的生產(chǎn)效率，且污染程度低、不破壞有效成分，提取的黃酮可直接應用在軟飲料或保健品中。

現(xiàn)有研究多采用正交試驗優(yōu)化山楂黃酮提取工藝（韓秋菊，2011；李寧豫等，2013；曹樂民等，2014），但正交試驗無法在試驗范圍內(nèi)確定影響因素的最佳組合和響應值的最優(yōu)值。響應面法既能提供各影響因子的交互作用，又能確保試驗值與理論值相差較小，具有精度高的特點（侯學敏等，2013；張昊等，2016）。本研究通過響應面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取廣西大果山楂葉黃酮的工藝，建立了料液比、提取溫度、提取時間3個因素對大果山楂葉黃酮提取率的回歸模型：Y=52.91+1.41A+1.08B+1.63C+0.51AB+0.89AC+0.052BC-4.53A2-0.97B2-1.36C2。通過響應面優(yōu)化分析得到黃酮提取最佳工藝條件為：超聲波功率140 W、提取溫度59 ℃、提取時間120 min、料液比1∶56，在此工藝下廣西大果山楂葉黃酮提取率為54.18 mg/g，高于韓秋菊（2011）、李寧豫等（2013）采用正交試驗優(yōu)化提取工藝獲得的山楂黃酮提取率；也高于大果山楂果實的黃酮提取率（22.68 mg/g）（黃欣欣等，2015），說明廣西大果山楂葉的黃酮含量較高。因素交互作用分析結果表明，提取溫度與料液比的交互作用對廣西大果山楂葉黃酮提取率影響顯著，提取時間與料液比、提取溫度與提取時間的交互作用對黃酮提取率影響不顯著，與周海旭等（2011）、黃欣欣等（2015）的研究結果不完全一致，可能與采用的試驗方法不同有關。

4 結論

響應面優(yōu)化得到的超聲波輔助水提存在一定差異廣西大果山楂葉黃酮工藝具有提取率高、精度高、工藝穩(wěn)定的優(yōu)點，可在生產(chǎn)中推廣應用。

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（責任編輯 羅 麗）