楊昌貴 肖承鴻 江維克 周濤 胡紅蓮

中圖分類(lèi)號(hào) R927 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）04-0470-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.04.10

摘 要 目的：提高十大功勞葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材樣品進(jìn)行定性鑒別。測(cè)定藥材樣品水分、灰分、醇浸出物。采用高效液相色譜法測(cè)定藥材樣品中鹽酸小檗堿的含量，色譜柱為WondaSil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25 ∶ 75，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為264 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：藥材樣品TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好。藥材樣品水分為3.92%～7.03%，總灰分為3.65%～6.95%，酸不溶性灰分為0.05%～1.03%，醇浸出物為10.87%～33.14%。鹽酸小檗堿檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.183～0.915 μg（r=0.999 9）；定量限、檢測(cè)限分別為0.143、0.095 μg；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD<2.0%（n=6）；加樣回收率為95.21%～103.10%（RSD=2.95%，n=6）。結(jié)論：藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過(guò)8.0%、6.0%、0.4%，醇浸出物、鹽酸小檗堿含量分別不得低于16.0%、1.0%。所建標(biāo)準(zhǔn)可用于十大功勞葉藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 十大功勞葉；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；高效液相色譜法；薄層色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To improve the quality standard of Folium Mahoniae. METHODS： TLC was used for qualitative identification. The contents of moisture， ash and ethanol extract were determined. The content of berberine hydrochloride was determined by HPLC. The determination was performed on WondaSil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05 mol/L monopotassium phosphate solution （25 ∶ 75，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 264 nm， column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： TLC spots were clear and well-separated. The contents of moisture， total ash， acid-insoluble ash and ethanol extract were 3.92%-7.03%， 3.65%-6.95%， 0.05%-1.03% and 10.87%-33.14%， respectively. The linear range of berberine hydrochloride was 0.183-0.915 ?g（r=0.999 9）； quantitation limit and detection limit was 0.143， 0.095 μg， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 2.0% （n=6）； recovery was 95.21%-103.10%（RSD=2.95%，n=6）. CONCLUSIONS： The content of moisture， total ash and acid-insoluble ash of medicinal materials is not exceed 8.0%， 6.0% and 0.4%， respectively. The content of ethanol extract and berberine hydrochloride is not less than 16.0% and 1.0%， respectively. Established standard can be used for quality control of Folium Mahoniae.

KEYWORDS Folium Mahoniae； Quality standard； HPLC； TLC

十大功勞葉味苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有滋陰、清熱、止咳化痰的功效，貴州少數(shù)民族多用于治療肺癆咳嗽、骨蒸潮熱[1]。我國(guó)十大功勞屬的植物有250多種[2]，在貴州境內(nèi)有14個(gè)種，分布廣泛[3]。2003年版《貴州中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載了長(zhǎng)柱十大功勞（Mahonia duclouxiana Gagnep）、小果十大功勞（M. bodinieri Gagnep）、細(xì)葉十大功勞[M. fortunei （Lindl.） Fedde]、寬苞十大功勞（M. eurybracteata Fedde）及闊葉十大功勞[M. bealei （Fort.） Carr]5個(gè)種作為十大功勞葉藥材來(lái)源[1]。但該標(biāo)準(zhǔn)中僅有藥材的性狀描述和闊葉十大功勞葉的橫切面顯微鑒別，難以評(píng)價(jià)藥材的優(yōu)劣。

小檗堿又名黃連素，為十大功勞葉藥材中主要的藥效成分，具有良好的抗菌、抗微生物、消炎的作用[4-5]，這與該藥材的治療范圍相符。本研究以鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿為定性指標(biāo)，建立了薄層色譜（TLC）定性鑒別方法；以鹽酸小檗堿為定量指標(biāo)，建立了高效液相色譜（HPLC）定量法；完成了水分、灰分和醇浸出物的檢查，制訂了合理的限度，旨在為提高十大功勞葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型HPLC儀，包括SPD-M20型二極管陣列檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SK1200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；ZF-2型三用紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：86.7%）、鹽酸巴馬汀對(duì)照品（批號(hào)：110732-201510，純度：87.4%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸藥根堿對(duì)照品（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MUST-16040702，純度：94.0%）；硅膠G（100～200目，青島海洋化工有限公司）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；水為純化水。

1.3 藥材

藥材樣品為本課題組實(shí)地采集（見(jiàn)表1），經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室江維克教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取藥材樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）2.5 g，置于提取瓶中，加乙醇50 mL，回流提取3 h，趁熱濾過(guò)，濾液濃縮至10 mL，作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿對(duì)照品各適量，加甲醇制成各待測(cè)成分質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨溶液（6 ∶ 3 ∶ 1.5 ∶ 1.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）為展開(kāi)劑，置于氨蒸氣飽和的展開(kāi)缸內(nèi)飽和20 min，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。

2.2 水分測(cè)定

取各批次藥材樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）適量，精密稱(chēng)定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0832水分測(cè)定法”的第二法烘干法[6]測(cè)定藥材樣品水分，每批平行測(cè)定2份。結(jié)果顯示，藥材樣品水分為3.92%～7.03%，平均值為5.75%，詳見(jiàn)表2。初步擬定十大功勞葉藥材水分不得過(guò)8.0%。

2.3 灰分測(cè)定

取各批次藥材樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）適量，精密稱(chēng)定，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2302灰分測(cè)定法”的總灰分測(cè)定法的酸不溶性灰分測(cè)定法[6]測(cè)定藥材樣品總灰分和酸不溶性灰分，每批平行測(cè)定2份。結(jié)果顯示，藥材樣品總灰分為3.65%～6.95%，平均值為5.50%；酸不溶性灰分為0.05%～1.03%，平均值為0.30%，詳見(jiàn)表2。初步擬定十大功勞葉藥材總灰分不得過(guò)6.0%，酸不溶性灰分不得過(guò)0.4%。

2.4 醇浸出物測(cè)定

取各批次藥材樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）適量，精密稱(chēng)定，提取溶液為50%乙醇溶液，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2201浸出物測(cè)定法”的熱浸法[6]測(cè)定藥材樣品醇浸出物，每批平行測(cè)定2份。結(jié)果顯示，藥材樣品醇浸出物為10.87%～33.14%，平均值為19.80%，詳見(jiàn)表2。初步擬定十大功勞葉藥材醇浸出物不得低于16.0%。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25 ∶ 75，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品23.18 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為2.318 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液0.2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，得鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為46.36 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.25 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率：100 W，頻率：59 kHz）處理45 min；取出，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 陰性對(duì)照溶液的制備 以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.5.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)>5 000；基線分離良好，分離度>1.5，詳見(jiàn)圖2。

2.5.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以鹽酸小檗堿進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程y=43 421x+11 613（r=0.999 9）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.183～0.915 μg。

2.5.7 定量限與檢測(cè)限考察 精密量取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限；當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿定量限、檢測(cè)限分別為0.143、0.095 μg。

2.5.8 精密度試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.00%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S-4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.68%（n=6），表明供試品溶液室溫放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.10 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取藥材樣品（編號(hào)：S-4）適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量。結(jié)果，鹽酸小檗堿含量平均值為0.9%，RSD為1.62%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量藥材樣品（編號(hào)：S-4）6份，每份80 mg，分別加入一定量的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.12 藥材樣品含量測(cè)定 取13批藥材樣品各適量，分別按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量。結(jié)果顯示，藥材樣品含量為0.21%～2.25%，平均值為1.48%。擬定十大功勞葉藥材中鹽酸小檗堿含量不得低于1.0%。

3 討論

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，對(duì)TLC鑒別中供試品溶液的制備方法進(jìn)行了考察，比較了甲醇浸漬24 h、甲醇超聲15 min、乙醇回流3 h 3種提取方法。結(jié)果，以甲醇浸漬和超聲方法提取時(shí)，鹽酸藥根堿斑點(diǎn)不清晰，而乙醇回流提取3 h后，待測(cè)成分斑點(diǎn)清晰，雜質(zhì)干擾小，故選擇后者進(jìn)行提取。同時(shí)，筆者比較了甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨溶液（6 ∶ 3 ∶ 1.5 ∶ 1.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）[8]、正丁醇-乙酸-水（7 ∶ 1 ∶ 2，V/V/V）[9]、氯仿-甲醇-氨溶液（9 ∶ 1 ∶ 0.5，V/V/V）[10]、苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨溶液（6 ∶ 3 ∶ 2 ∶ 2 ∶ 0.3，V/V/V/V/V）[11]4種展開(kāi)劑，發(fā)現(xiàn)待測(cè)成分在甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨溶液（6 ∶ 3 ∶ 1.5 ∶ 1.5 ∶ 0.5，V/V/V/V/V）中展開(kāi)良好、斑點(diǎn)清晰、無(wú)邊緣效應(yīng)，因此以其作為T(mén)LC的展開(kāi)劑。

十大功勞葉藥材藥效成分以生物堿類(lèi)為主[7]，故按“烘干法”測(cè)定水分。生物堿類(lèi)成分易溶于乙醇，控制醇浸出物含量，對(duì)確保藥材樣品質(zhì)量穩(wěn)定具有重要意義。筆者在醇浸出物測(cè)定時(shí)比較了冷浸、熱浸2種方法，發(fā)現(xiàn)熱浸法優(yōu)于冷浸法；同時(shí)，考察了不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的提取率，結(jié)果顯示50%乙醇溶液提取率最高。檢測(cè)十大功勞葉藥材樣品總灰分和酸不溶性灰分含量，可控制藥材樣品中泥土、砂石等外來(lái)無(wú)機(jī)物的量，對(duì)確保藥材樣品凈度具有重要意義。

在HPLC含量測(cè)定中，通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器掃描，筆者發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿在229、264、345 nm處均有吸收峰，而在229 nm處峰面積雖然最大，但接近末端吸收，易受到雜峰的干擾，故選擇264 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在供試品溶液制備中，筆者比較了回流、超聲2種提取方法，發(fā)現(xiàn)后者較前者待測(cè)成分含量更高，故采用超聲提取。而超聲提取45、60 min效果相當(dāng)，從保證提取率和節(jié)約時(shí)間兩方面綜合考慮，將超聲提取時(shí)間確定為45 min。在流動(dòng)相選擇過(guò)程中，筆者嘗試過(guò)不同系統(tǒng)及比例[8，12]，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（25 ∶ 75，V/V）為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離度和峰形均較好。

綜上所述，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于十大功勞葉藥材的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-05-08 修回日期：2017-06-15）

（編輯：張 靜）